论文摘要
为了掌握四川规模化养鸡场魏氏梭菌的分布现状,本试验首先从四川省规模化鸡场无临床病症鸡群的新鲜粪便、肠道内容物等样品中分离魏氏梭菌,然后进行分子分型研究,最后采用双层平板法筛选对魏氏梭菌具有一定生物拮抗作用的有益菌株,为预防和治疗鸡魏氏梭菌病提供理论依据和试验材料。本试验从四川省雅安、名山、双流、德阳等地的规模化养鸡场采集健康鸡的新鲜粪便、肠道内容物样品共150份。通过比较1%葡萄糖血琼脂、卡那霉素加卵黄CW琼脂平板（CW平板）、SPS平板、TSC平板、TSN平板5种培养基对50株粪便样品中魏氏梭菌的分离状况,发现TSC平板表现出对粪便样品中的干扰菌具有很好的拮抗压力,而在TSC平板上魏氏梭菌长势良好,且形成典型易于分辨的菌落形态。最后选定TSC平板作为分离鸡粪便样品中魏氏梭菌的最佳选择性培养基。采用TSC平板对全部150份样品做魏氏梭菌分离,然后将分离到的菌株接种到紫牛乳培养基中,结合紫牛乳是否出现“爆裂发酵”特征,最终确定初步分离到8株鸡源魏氏梭菌。将分离的菌株纯化培养后,参照Yoo等实验公布的引物进行多重PCR（multiplex-PCR）反应,对分离的菌株进行病原基因确认,同时对其作血清分型。结果8株菌均可扩增出1条400bp左右的特异性条带,扩增产物测序结果和报道的α毒素序列完全一致。另外对大肠埃希氏菌、沙门氏杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌在相同的反应体系中进行扩增,没有扩增出特异性产物,说明该方法具有较高的特异性。鉴定结果证实8株分离菌株为魏氏梭菌,且血清型为A型。把血清型相同的魏氏梭菌归为同一组,利用广泛存在于肠杆菌科的“ERIC”、“REP”重复序列设计引物,依照PCR后的指纹图谱,进一步对属于同一血清型的魏氏梭菌做亚型分类。按照菌株指纹图谱相似率达到80%则判定为同一菌株的标准,ERIC-PCR将8株A型魏氏梭菌分为5个亚型,REP-PCR分为3个亚型。可见多重序列PCR反应能够对魏氏梭菌的亚型做有效分类,比较两种重复序列反应,ERIC-PCR对魏氏梭菌亚型分类具有更好效果。利用双层琼脂法,从来自鸡源的17株有益细菌中筛选具有拮抗魏氏梭菌作用的菌株。在D11、D22、E31、E41、E42、F61、G31、G52、H51这9乳酸菌株中筛选出3株乳酸菌E41、G31、H51;在ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、Z2、JS01这8株芽孢杆菌株中筛选出2株纳豆芽胞杆菌ND2、ND3和一株枯草芽胞杆菌Z2。这些菌株可望作为鸡魏氏梭菌病防治益生素候选菌株。