维生素K2干预肝癌的实验研究

论文摘要

原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）是一种人类常见的恶性肿瘤,恶性程度高,容易复发转移。据统计,在全球癌症中,肝癌的发病率位居第五位,病死率位居第三位。在我国,肝癌病死率位居恶性肿瘤死亡率的第二位。乙型肝炎是肝癌发生的主要原因。我国是乙肝大国,肝细胞性肝癌合并肝硬化者占85%-90%,其中大多数系病毒性肝炎后肝硬化,尤其是乙型肝炎后肝硬化。而肝硬化病人合并肝癌者可达50%左右。我国的肝癌研究于20世纪50年代从临床起步,历经肝癌的手术切除、肝动脉化疗栓塞（Transcatheter arterialchemoembolization,TACE）、瘤内无水乙醇注射治疗（Percutaneous ethanolinjection,PEI）、射频局部消融（Radio frequency ablation,RFA）、肝移植、生物治疗、分子靶向治疗等等。半个世纪来肝癌的临床与基础研究有了不少进展,五年生存率也有所提高,但肝癌总的预后仍差。大多数肝癌患者因伴有肝硬化、肝功能不能耐受手术或化疗栓塞而失去治疗机会。因此,亟需寻找更为有效、副作用小的药物或治疗手段。维生素K2即是近年来发现的还具有抗肿瘤作用的药物。维生素K2作为谷氨酸羧化酶的辅酶,对凝血酶原及其它凝血因子中的谷氨酸残基进行羧化,进而参与凝血功能。近年的研究报道,维生素K2有抑制人类肿瘤细胞生长的作用。维生素K2的抗肝癌作用已经在临床上的得到证实,如日本学者Habu以女性肝硬化患者为对象,观察维生素K2治疗骨质疏松的疗效时,无意中发现,服用维生素K2的女性肝硬化患者的肝癌发生率（2/21）明显低于对照组（9/19）,P＜0.01;提示维生素K2对女性肝硬化病人有预防肝癌发生的作用。但作用机理不明。也有报道,维生素K2能诱导肺癌、卵巢癌、胃癌等多种实体瘤细胞和血液系统恶性肿瘤细胞凋亡。我所在的研究小组在前期研究中发现,维生素K2对人肝癌高转移细胞系MHCC97-H具有体外抑制粘附、抑制侵袭、抑制细胞生长的作用。本实验继前期研究,仍以MHCC97-H为靶细胞,进一步探讨维生素K2对细胞的凋亡诱导作用及其作用机制;并用同一细胞系建立高转移荷人肝癌裸鼠模型,观察维生素K2对荷瘤裸鼠肝癌肺转移和生存期的影响;为维生素K2应用于临床治疗和预防肝癌提供理论和实验依据。第一部分细胞实验——维生素K2对肝癌细胞的凋亡诱导作用及其机制探讨研究表明,维生素K2能诱导多种实体瘤细胞和血液系统恶性肿瘤细胞凋亡。但是否对于具有高转移潜能的人肝癌细胞有凋亡诱导作用尚不清楚。我们以MHCC97-H细胞为靶细胞,检测维生素K2对细胞的凋亡诱导作用。并通过检测凋亡相关基因mRNA的表达,了解其作用机制。（一）维生素K2对MHCC97-H细胞的凋亡诱导作用将终浓度为100μM的维生素K2与MHCC97-H细胞共同孵育3小时或6小时,设对照组。胰酶消化后收集细胞,用Binding buffer重悬细胞,取100μl加5μl Annexin V-FITC和5μl PI,25℃下避光温育细胞15min后,加入400μlAnnexin V Binding缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡率。处于右上象限AnnexinV-FITC（+）/PI（+）和右下象限Annexin V-FITC（+）/PI（-）区域内的细胞分别被认为是凋亡晚期和凋亡早期细胞。结果显示,维生素K2对人肝癌MHCC97-H细胞存在凋亡诱导作用。当维生素K2作用细胞6h后,细胞凋亡率为（28.5±1.6）%,与对照组（2.8±4.8）%比较,有明显差异,P＜0.05。而维生素K2作用细胞3h后细胞凋亡率为（7.3±3.4）%,与对照组（3.5±2.9）%比较,无显著差异,P＞0.05。（二）RT-PCR方法检测easpase-3、Bcl-2及Bax mRNA表达将不同浓度的维生素K2（20μmol/L、50μmol/L及100μmol/L）作用MHCC97-H细胞后,分别于24h、48h及72h,用RT-PCR方法检测caspase-3、Bel-2及Bax的mRNA表达。结果显示:caspase-3 mRNA的表达对维生素K2有浓度和时间依赖。当100μM的维生素K2作用细胞72h后,caspase-3 mRNA的表达为0.603±0.098,与对照组（0.270±0.132）比较有显著差异,P＜0.05。在同种浓度下,随着处理时间的延长,caspase-3 mRNA的表达也随着增多。无论维生素K2作用细胞与否,在MHCC97-H细胞中均未检测到Bcl-2 mRNA的表达。维生素K2作用前后,细胞BaxmRNA的表达无明显变化。第二部分动物实验——维生素K2对荷瘤裸鼠肺转移和生存期的影响小规模的临床试验报道,维生素K2能降低女性肝炎肝硬化患者的肝癌发生率;能降低肝癌患者术后的复发率,延长患者生存期。为进一步明确维生素K2在体内的抗肝癌作用,本实验以复旦大学肝癌研究所建立的高转移荷人肝癌裸鼠模型为研究对象,观察维生素K2对荷瘤裸鼠肺转移和生存期的影响。（一）人肝癌裸鼠模型的建立高转移人肝癌裸鼠原位移植模型由复旦大学附属中山医院肝癌研究所建立。将MHCC97-H细胞接种于裸鼠皮下,六周后成瘤;再将皮下肿瘤原位移植到裸鼠肝脏。24只裸鼠随机分成治疗组和对照组（各组12只）。（二）维生素K2对裸鼠肝癌肺转移及生存期的影响裸鼠肿瘤原位移植后第二天起,治疗组予维生素K2 30mg·kg-1·d-1灌胃;对照组为同等剂量的维生素K2溶解液（食用油）。6周后,各组分别随机抽样6只裸鼠,断颈处死,取出肺脏,福尔马林固定,石蜡包埋、切片、HE染色,显微镜下计数每只裸鼠的肺转移灶个数,计算平均值。其余各组剩余的6只裸鼠继续治疗、饲养,直至裸鼠自然死亡,记录生存期。结果显示,维生素K2治疗组肺转移灶个数为（4.6±1.95个）,与对照组（12±6.6个）相比,有显著性差异,P＜0.05,说明维生素K2明显减少裸鼠肝癌肺转移灶个数;Kaplan-Meier法进行裸鼠的生存分析,Log-rank检验,P＜0.05,有显著性差异,提示维生素K2明显延长荷人肝癌裸鼠的生存期。主要结论1.维生素K2在体外能诱导具有高转移潜能的人肝癌细胞系MHCC97-H细胞凋亡。2.维生素K2作用细胞后高表达caspase-3 mRNA,提示caspase-3参与了凋亡过程的调控。3.维生素K2在荷人肝癌裸鼠体内能抑制肝癌细胞的肺转移,并延长裸鼠的生存期。这一结果可能是由于维生素K2能抑制肝癌细胞粘附、侵袭、生长,并诱导其凋亡等共同作用的结果。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 维生素K2对肝癌细胞的凋亡诱导作用及其机制探讨
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 维生素K2对荷瘤裸鼠肺转移和生存期的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢