论文摘要
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病。据世界卫生组织报告,全球新确诊和死于癌症的人数都在逐年增加,肿瘤的治疗已经成为重大研究课题。siRNA药物通过诱导RNA干扰（RNAi）效应为抗肿瘤治疗提供了,一种有前景的手段。但是,siRNA药物本身半衰期短、稳定性差、易被核酸酶降解、亲水性强且带负电,所以不易透过带负电荷的细胞膜进入细胞发挥治疗作用。缺乏能够高效率递送siRNA载体的现状严重限制了其应用。本课题构建和筛选出能够高效递送siRNA的非病毒载体,并应用筛选出的载体加载siRNA制备纳米粒,进行体内外抗肿瘤治疗研究。首先,通过化学反应分别将6种细胞穿膜肽（CPPs）共价结合到壳聚糖高分子链游离氨基末端,制备6种CPP-g-CS载体,并利用FTIR和1H NMR等分析方法对其结构进行鉴定。然后选用不同类型的细胞,通过MTT实验对CPP-g-CS载体进行细胞毒性评价,结果表明6种载体的细胞存活率均>87%。以复凝聚法制备载siRNA纳米粒,对其形态、粒径、Zeta电位、稳定性等理化性质进行研究,结果显示所制备的纳米粒是表面带有+18.58mV的正电荷、大小为200nm左右的球形粒子,粒径分布范围较窄。以不同CPP-g-CS为载体,选用干扰荧光素酶报告基因（luciferase）表达的siRNA为模型药物,通过报告基因分析探讨纳米粒沉默luciferase基因表达的规律。筛选出高效递送siRNA沉默靶基因表达的载体,结果表明TAT-g-CS/siRNA及6R-g-CS/siRNA的靶基因沉默能力最强,对外源性基因的抑制效率分别达到了73.7%和64.9%；对内源性基因的抑制效率分别达到75.3%和64.92%。同时利用激光共聚焦观察纳米粒的入胞情况,流式细胞术研究了其摄取效率及转染机制,并考察了时间和剂量因素对靶基因沉默效率的影响。选择靶向Survivin和Bcl-2基因的功能性siRNA制备纳米粒,研究纳米粒对肿瘤细胞体外杀伤效果。结果表明siRNA剂量为50pmol/孔,孵育48小时后,两种纳米粒抑制细胞增殖的效率达到最大,分别为55.6%和52.8%,诱导细胞产生凋亡比例分别为98.77%和99.2%。选择筛选出来的载体加载靶向Survivin和Bcl-2基因的功能性siRNA制备纳米粒,对荷瘤小鼠进行瘤内注射治疗乳腺癌,通过传统肿瘤监测手段测量肿瘤体积的变化、解剖学观察肺组织表面转移灶的多少和瘤重的差异,经病理切片分析肺组织表面的病理变化,综合评价载功能性siRNA纳米粒体内抗肿瘤生长、转移的效果及对荷瘤小鼠生存率的影响。结果显示两种纳米粒都可以显著抑制小鼠乳腺癌的生长及转移,并能有效延长荷瘤小鼠的生存期。同时,应用活体动物成像技术观察TAT-g-CS/siRNASur纳米粒抑制肿瘤转移的效果,结果也确证了TAT-g-CS/siRNASur纳米粒能够有效抑制肿瘤转移。本课题用6种CPP对壳聚糖进行结构修饰,通过探讨不同载体对靶基因表达的沉默效率,筛选获得高效siRNA递送载体,相对于仅用一种材料进行修饰而无筛选过程的其他同类研究,本课题的设计思路更加科学,更容易获得预期目标及较理想的结果。另外,目前关于siRNA递送的研究大都止于报告基因或者治疗基因的体外研究。而本课题应用筛选出的载体加载2种治疗性siRNA制备纳米粒,进行动物体内抗肿瘤研究,评价载siRNA纳米粒的肿瘤治疗效果及其对荷瘤小鼠生存率的影响,同时应用活体动物成像观察纳米粒抑制肿瘤转移的效果,结果表明载功能siRNA纳米粒在体内外均取得良好的治疗效果。为siRNA递送载体的研发提供理论依据、方法参考和技术借鉴。
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摘要Abstract前言参考文献第一章 CPP-g-CS载体的合成、结构表征及细胞毒性评价第一节 不同CPP-g-CS载体的合成及结构表征一、仪器、材料与试剂二、实验部分2.1 载体的合成2.2 产物结构表征三、实验结果3.1 合成路线3.2 合成产物的FTIR图谱3.3 合成产物的核磁图谱第二节 不同CPP-g-CS载体的细胞毒性评价一、仪器与试剂二、实验部分2.1 细胞培养2.2 MTT溶液的配制2.3 工作溶液的配制2.4 载体的体外细胞毒性评价三、实验结果3.1 CPP-g-CS载体的体外细胞毒性评价3.2 不同取代度的载体体外细胞毒性检测四、讨论本章小结参考文献第二章 载siRNA纳米粒的制备及表征第一节 纳米粒制备工艺的优化一、仪器与试剂二、实验部分2.1 工作溶液的配制2.2 单因素考察优化制备工艺三、实验结果3.1 预热温度的影响3.2 脱水剂浓度的影响3.3 涡旋时间的影响第二节 纳米粒理化性质的研究一、仪器、材料与试剂二、实验部分2.1 纳米粒的制备2.2 凝胶阻滞分析载体对siRNA的包载情况2.3 纳米粒粒径及外观研究2.4 纳米粒的稳定性三、实验结果3.1 凝胶阻滞实验3.2 纳米粒粒径测定3.3 纳米粒的形态研究3.4 纳米粒的稳定性研究四、讨论本章小结参考文献第三章 载siRNA纳米粒沉默靶基因能力的研究一、实验材料二、实验部分2.1 质粒的制备2.1.1 质粒基因的扩增2.1.2 质粒基因的提取2.1.3 质粒浓度及纯度的测定2.2 载siRNA纳米粒抑制外源基因Luciferase表达的研究2.2.1 不同siRNA剂量纳米粒抑制外源基因表达的研究2.2.2 不同取代度载体抑制外源基因表达的研究2.2.3 转染时间和载体对纳米粒抑制外源基因表达影响的研究2.3、载siRNA纳米粒抑制内源性基因表达的研究2.3.1 不同取代度纳米粒抑制内源性Luciferase表达的研究2.3.2 不同siRNA剂量纳米粒抑制内源性Luciferase表达的研究2.3.3 不同载体及转染时间对Luciferase表达的研究2.4 Luciferase活力的测定2.4.1 细胞裂解液的配制2.4.2 Luciferase底物溶液的配制2.4.3 Luciferase活力的测定三、实验结果3.1 质粒的扩增、提取、鉴定3.1.1 培养板菌落培养3.1.2 质粒浓度及纯度的测定3.2 载siRNA纳米粒抑制外源性Luciferase基因表达的研究3.2.1 siRNA剂量及转染时间影响外源性Luciferase表达的研究3.2.2 不同取代度纳米粒影响外源性Luciferase表达的研究3.2.3 转染时间和不同载体影响外源性Luciferase表达的研究3.3 纳米粒抑制内源性Luciferase表达的研究3.3.1 不同取代度纳米粒影响内源性Luciferase表达的研究3.3.2 siRNA转染剂量影响内源性Luciferase表达的研究3.3.3 转染时间和不同载体纳米粒影响内源性Luciferase表达的研究四、讨论本章小结参考文献第四章 载siRNA纳米粒体外细胞摄取机制研究一、仪器与试剂二、实验部分2.1 细胞摄取效率的影响因素研究2.2 流式细胞仪检测纳米粒摄取情况2.3 激光共聚焦观察纳米粒入胞情况2.4 TAT-g-CS/siRNA纳米粒入胞机制的研究三、实验结果3.1. 细胞摄取研究3.2 激光共聚焦观察细胞入胞情况3.3 TAT-g-CS/siRNA纳米粒摄取机制研究结果四、讨论本章小结参考文献第五章 载功能siRNA纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤研究第一节 靶向Survivin纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤效果一、仪器及试剂二、实验部分Sur纳米粒对肿瘤细胞杀伤能力的研究'>2.1 载siRNSur纳米粒对肿瘤细胞杀伤能力的研究Sur纳米粒诱导细胞凋亡的研究'>2.2 载siRNASur纳米粒诱导细胞凋亡的研究2.3 统计学处理三. 实验结果3.1 划痕实验Sur纳米粒抑制细胞增殖条件的考察'>3.2 载siRNASur纳米粒抑制细胞增殖条件的考察sur纳米粒抑制4T1细胞增殖的研究'>3.3 载siRNAsur纳米粒抑制4T1细胞增殖的研究3.4 凋亡细胞形态学观察Sur纳米粒诱导细胞凋亡的研究'>3.5 载siRNASur纳米粒诱导细胞凋亡的研究第二节 靶向Bcl-2的纳米粒体外肿瘤细胞杀伤效果一、仪器及试剂二、实验部分Bcl-2纳米粒对肿瘤细胞杀伤能力的研究'>2.1 载siRNABcl-2纳米粒对肿瘤细胞杀伤能力的研究Bcl-2纳米粒诱导细胞凋亡的研究'>2.2 载siRNABcl-2纳米粒诱导细胞凋亡的研究2.3 统计学处理三、实验结果3.1 划痕实验Bcl-2纳米粒抑制细胞增殖'>3.2 显微镜观察载siRNABcl-2纳米粒抑制细胞增殖Bcl-2纳米粒抑制细胞增殖条件的考察'>3.3 载siRNABBcl-2纳米粒抑制细胞增殖条件的考察Bcl-2纳米粒抑制4T1细胞增殖的研究'>3.4 载siRNABcl-2纳米粒抑制4T1细胞增殖的研究Bcl-2纳米粒诱导细胞凋亡'>3.5 流式检测载siRNABcl-2纳米粒诱导细胞凋亡四、讨论本章小结参考文献第六章 载治疗siRNA纳米粒的动物体内抗肿瘤研究第一节 TAT-g-CS/siRNA纳米粒体内抗肿瘤评价一、仪器、材料、试剂及实验动物二、实验方法2.1 Bouin’s固定液的配制2.2 中性甲醛的配制2.3 载治疗siRNA纳米粒对乳腺癌治疗的研究Sur纳米粒抑制肿瘤转移的效果'>2.4 动物活体成像仪观察TAT-g-CS/siRNASur纳米粒抑制肿瘤转移的效果Sur纳米粒对荷瘤小鼠生存率影响的研究'>2.5 TAT-g-CS/siKNASur纳米粒对荷瘤小鼠生存率影响的研究三、实验结果Sur纳米粒对肿瘤体积的影响'>3.1 TAT-g-CS/siRNASur纳米粒对肿瘤体积的影响Bcl-2纳米粒对肿瘤体积的影响'>3.2 TAT-g-CS/siRNABcl-2纳米粒对肿瘤体积的影响3.3 TAT-g-CS/siRNA纳米粒对瘤重的影响Sur纳米粒抑制肿瘤转移的研究'>3.4 TAT-g-CS/siRNASur纳米粒抑制肿瘤转移的研究Sur纳米粒抗肿瘤效果'>3.5 活体成像观察TAT-g-CS/siRNASur纳米粒抗肿瘤效果Sur纳米粒对荷瘤小鼠生存率的影响'>3.6 TAT-g-CS/siRNASur纳米粒对荷瘤小鼠生存率的影响第二节 6R-g-CS/siRNA纳米粒体内抗肿瘤评价一、仪器及试剂二、实验方法载治疗siRNA纳米粒对乳腺癌治疗的考察三、实验结果3.1 6R-g-CS/siRNA纳米粒抑制乳腺癌肿瘤生长的研究3.2. 6R-g-CS/siRNA纳米粒对瘤重的影响3.3 6R-g-CS/siRNA肺组织固定后照片Sur纳米粒治疗后病理的变化'>3.4. 6R-g-CS/siRNASur纳米粒治疗后病理的变化四、讨论本章小结参考文献全文总结及展望综述参考文献作者简介致谢
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标签：细胞穿膜肽论文; 纳米粒论文; 抗肿瘤治疗论文; 壳聚糖论文;
基于细胞穿膜肽修饰的新型非病毒载体的构建、筛选及递送功能siRNA治疗恶性肿瘤的研究
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