论文摘要
各种生物在其生命周期的某些阶段都要受到水分限制的影响。因此,在它们的进化过程中形成了许多应对水分亏缺的策略,包括:改变酶活性和基因表达。在植物中有一类亲水性蛋白,叫做胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）,在种子成熟后期高水平积累。在植物遇到干旱、冰冻、盐胁迫或用植物激素ABA处理时,植物组织同样会积累LEA蛋白。植物LEA蛋白有助于植物抵御有干旱和冷休克引起的水分胁迫。然而,虽然人们已提出LEA蛋白的各种功能,但它确切的作用还不太清楚。大多数LEA蛋白具有高度亲水性和热稳定性。根据氨基酸序列的同源性和特殊结构特征可将LEA蛋白至少分为五组。第1、2和3组蛋白有各自特殊的基元序列,但是第4组和第5组蛋白却缺少标志性的基元序列或一致性的序列。一些LEA蛋白可能具有保护生物膜的功能,它们能将逆境造成的损害减少到最小。有人推测LEA蛋白能保护细胞结构和大分子结构并且使分子解毒以减少由胁迫引起的离子浓度的增加。此外,LEA蛋白同样有助于干燥细胞中的“玻璃化”状态的形成。由于LEA蛋白在植物抗逆性方面的重要作用,LEA蛋白的研究已成为现代植物分子生物学研究的热点之一。蜡梅（Chimonanthus praecox（linn.）Link）蜡梅科蜡梅属腊梅是我国特产的传统名贵观赏花木,有着悠久的栽培历史和丰富的蜡梅文化。唐代诗人李商隐称蜡梅为寒梅,有“知访寒梅过野塘”句。蜡梅花开春前,为百花之先,特别是虎蹄梅,农历十月即放花,故人称早梅。蜡梅先花后叶,花与叶不相见,花开之时枝干枯瘦,故又名干枝梅。蜡梅花开之日多是瑞雪飞扬,欲赏蜡梅,待雪后,踏雪而至,故又名雪梅。又因蜡梅花入冬初放,冬尽而结实伴着冬天,故又名冬梅。本实验已在构建蜡梅cDNA文库及EST分析的基础上,通过随机克隆测序,克隆了2个蜡梅LEA蛋白的cDNA基因,命名为Cplea1和Cplea2。首先对Cplea1和Cplea2基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,得到其核酸和蛋白序列组成、蛋白质疏水性、跨膜区、二级结构预测、信号肽、磷酸化和糖基化位点等多种数据。然后扩增回收目的基因片段。最后构建原核表达载体建立原核表达体系。主要实验结果如下:1.在构建蜡梅cDNA文库及EST分析的基础上,通过随机克隆测序,克隆了2个蜡梅LEA蛋白的cDNA基因,命名为Cplea1和Cplea2。Cplea1的编码蛋白与毛果杨和芜菁LEA蛋白氨基酸序列相似性较高;Cplea2的编码蛋白与毛果杨和榛子LEA蛋白氨基酸序列相似性较高。进一步序列比较分析表明,Cplea1和Cplea2是从蜡梅中克隆到的2个编码LEA蛋白的基因。Cplea1 cDNA基因全长577bp,其中含有273bp的开放阅读框,编码一个含有90个氨基酸的LEA蛋白;Cplea2 cDNA基因全长572bp,其中含有258bp的开放阅读框,编码一个含有85个氨基酸的LEA蛋白。2.运用生物信息学方法分析两种目的基因及其编码蛋白的序列并预测蛋白的结构。分析结果显示,两种蛋白具有良好的亲水性。CpLEA1蛋白中Ala、Lys、Gln、Ser的含量最高,CpLEA2蛋白中Ala、Gln、Ser、Thr的含量最高。两种蛋白的二级结构中均有大量的α螺旋。两种蛋白含有多个磷酸化位点,推测翻译后蛋白可能进行多样化修饰,这可能与LEA蛋白功能的多样化有关。3.将蜡梅Cplea1和Cplea2基因构建到原核表达载体pET-32a（+）中,构建含有两种基因的原核表达载体（pET32- Cplea1,pET32- Cplea2,）。转化宿主大肠杆菌BL21诱导表达,获得了重组蛋白。从诱导温度、IPTG终浓度和诱导表达时间三个方面优化重组蛋白的表达体系。