盾壳霉产孢相关基因CMPEX2的克隆及其功能验证

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotirium）的重寄生菌,是一种重要的生防菌。研究盾壳霉的分生孢子形成有利于促进该生防菌的规模化生产。本文以从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选到的产孢缺陷型突变体ZS-1T16229菌株为材料克隆到产孢相关的基因,并对该基因进行功能验证,结果如下:突变体ZS-1T16229的菌丝偏向于培养基质中生长,菌丝生长速度与出发菌株ZS-1没有显著差别,但其生物学产量显著下降,寄生致腐菌核的能力下降了75%,丧失产生抗细菌物质的能力。在PDA培养基上,突变体ZS-1T16229菌株几乎不产孢,但与核盘菌对峙培养时,核盘菌能刺激其产孢,在PDA中添加核盘菌发酵液后,亦可促使其恢复部分产孢能力。实验室前期采用TAIL-PCR获得了突变体ZS-1T16229的T-DNA插入位点侧翼的基因组DNA片段,本研究采用RT-PCR技术对T-DNA标记插入位点的基因组DNA进行了进一步克隆,共获得了大小为2037 bp的DNA片段。利用GenScan软件进行了阅读框（ORF）预测:位于第435nt开始的ATG为起始密码子,该DNA片段含有一个完整的开放性阅读框架（核苷酸的位置在435-1961）,编码508 aa。对推定的氨基酸序列进行功能预测,发现该序列中含有保守区域,即PEX2-PEX12域。该氨基酸序列与其他真菌的PEX2具有高度的同源性,如与烟曲霉（Aspergillus nidulans）Af293菌株的PEX2相同部位等同的氨基酸为53%,类似的氨基酸达68%;与产黄青霉（Penicillium chrysogenum）的PEX2相同部位等同的氨基酸为52%,类似的氨基酸达64%;故命名该基因为CMPEX2。T-DNA标记插入该基因中间位置。RT-PCR结果表明CMPEX2基因在ZS-1T16229基因组中不表达,在菌株ZS-1的基因组中表达。构建了CMPEX2基因敲除载体和互补载体,利用农杆菌介导转化的方法分别转化ZS-1菌株和突变体ZS-1T16229菌株,获得了5个CMPEX2基因敲除转化子PD03、PD35、PD58、PD78、PD92和1个CMPEX2基因互补转化子PC01,5个CMPEX2基因敲除转化子与出发菌株ZS-1相比,产孢能力显著下降,表型与突变体ZS-1T16229一致;而互补转化子PC01产孢能力比突变体ZS-1T16229菌株显著提高,表型与ZS-1菌株一致。证实CMPEX2与盾壳霉的分生孢子形成相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌的研究进展
• 1.1 核盘菌及其危害
• 1.2 作物菌核病的防治
• 2 盾壳霉的研究进展
• 2.1 盾壳霉的生物学特性
• 2.2 盾壳霉的生态学特性
• 2.3 盾壳霉的分子生物学研究
• 3 过氧化物酶体研究进展
• 4 农杆菌介导的真菌遗传转化研究
• 5 基因功能的研究方法
• 6 本项研究的意义
• 第二章 盾壳霉产孢缺陷型突变体ZS-1T16229菌株的基本生物学性状的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 突变体菌株ZS-1T16229的形态特征观察
• 1.2.2 突变体菌株ZS-1T16229菌丝生长速度的测定
• 1.2.3 突变体菌株ZS-1T16229的生物产量测定
• 1.2.4 突变体菌株ZS-1T16229在PDA培养基上产抗真菌物质能力测定
• 1.2.5 突变体菌株ZS-1T16229在PDA培养基上产抗细菌物质能力测定
• 1.2.6 突变体菌株ZS-1T16229寄生致腐核盘菌菌核能力的测定
• 1.2.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 突变体ZS-1T16229菌株的形态特征观察
• 2.2 突变体ZS-1T16229菌丝的生长速度
• 2.3 突变体ZS-1T16229的生物产量低
• 2.4 突变体ZS-1T16229不具产生抗真菌物质的能力
• 2.5 核盘菌促使突变体ZS-1T16229恢复产孢
• 2.6 突变体ZS-1T16229丧失产生抗细菌物质的能力
• 2.7 突变体ZS-1T16229具微弱的寄生致腐菌核能力
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第三章 盾壳霉产孢相关基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基、载体及抗生素
• 1.1.3 质粒抽提用溶液
• 1.1.4 其它溶液及试剂
• 1.1.5 限制性内切酶及其它酶类、试剂盒及其它试剂
• 1.1.6 DNA分子量标记
• 1.2 方法
• 1.2.1 ZS-1菌株RNA的提取
• 1.2.2 通过RACE获得3'末端cDNA
• 1.2.3 目的片段的回收及纯化
• 1.2.4 回收产物与克隆载体连接
• 1.2.5 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物
• 1.2.6 重组质粒的筛选、提取及鉴定
• 1.2.7 克隆序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 CMPEX2全长序列的克隆
• 2.2 CMPEX2全长序列分析
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第四章 盾壳霉产孢相关基因功能的验证
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、载体、抗生素及引物
• 1.1.2 试剂及培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 RT-PCR验证ZS-1T16229中CMPEX2基因的表达
• 1.2.2 盾壳霉CMPEX2敲除载体的构建
• 1.2.3 盾壳霉CMPEX2互补载体的构建
• 1.2.4 含重组质粒农杆菌的获取
• 1.2.5 农杆菌介导转化盾壳霉ZS-1菌株
• 1.2.6 盾壳霉CMPEX2敲除转化子PCP鉴定
• 1.2.7 盾壳霉CMPEX2敲除转化子基本生物学性状的测定
• 1.2.8 农杆菌介导转化盾壳霉突变体ZS-1T16229菌株
• 2 结果与分析
• 2.1 ZS-1T16229中CMPEX2基因不表达
• 2.2 盾壳霉CMPEX2敲除载体的构建及鉴定
• 2.3 盾壳霉CMPEX2互补载体的构建及鉴定
• 2.4 含重组质粒农杆菌的鉴定
• 2.5 农杆菌介导介导转化盾壳霉ZS-1菌株
• 2.6 盾壳霉CMPEX2敲除转化子PCR鉴定结果
• 2.7 盾壳霉CMPEX2敲除转化子基本生物学性状的测定结果
• 2.7.1 敲除转化子形态特征的观察
• 2.7.2 敲除转化子生长速度的测定
• 2.7.3 敲除转化子在PDA培养基上产抗真菌物质能力的测定
• 2.8 农杆菌介导转化盾壳霉突变体ZS-1T16229菌株
• 2.9 盾壳霉CMPEX2互补转化子PCR鉴定结果
• 2.10 盾壳霉CMPEX2基因互补转化子基本生物学性状的测定结果
• 2.10.1 互补转化子形态特征的观察
• 2.10.2 互补转化子生长速度的测定
• 2.10.3 互补转化子在PDA培养基上产抗真菌物质能力的测定
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢