论文摘要
目的:构建人Sox9基因慢病毒载体,体外Sox9慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）,观察Sox9基因转染对hUC-MSCs生物学特性的影响,以及经Sox9基因修饰的hUC-MSCs在单层培养条件下向软骨细胞分化的能力,为软骨组织损伤及退变性疾病的细胞学及基因治疗提供实验依据。方法:通过PCR的方法获得人Sox9基因编码区片段,将该片段克隆入慢病毒载体Pwpxl-MOD中产生Pwpxl-MOD/Sox9 ,通过酶切测序鉴定慢病毒载体,将Pwpxl-MOD/Sox9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,包装成含有Sox9基因的重组慢病毒。采用酶消化法从人脐带基质中获取间充质干细胞,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,诱导向成骨、脂肪分化以观察其多向分化潜能。包装好的慢病毒体外转染hUC-MSCs,利用荧光倒置相差显微镜观察转基因细胞的形态变化、绿色荧光表达（GFP）情况,转染后48h确定基因转染效率。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法及免疫印迹（Western-blot）检测Sox9在hUC-MSCs中的表达;四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响。在高密度单层培养条件下,不增加生长因子、地塞米松等软骨诱导液,将Sox9基因修饰的hUC-MSCs培养分化21d, RT-PCR、Western-blot、免疫组化及免疫荧光染色、阿利新兰染色检测特异性软骨细胞分子标志Ⅱ型胶原、Agrrecan的表达以及蛋白多糖的分泌情况。结果:酶切、测序鉴定证实慢病毒载体Pwpxl-MOD中插人片段为基因Sox9。经检测包装好的慢病毒滴度为6.0×107TU/ml;从人脐带基质分离出的hUC-MSCs形态类似于成纤维样细胞,CD29（95.9%）、CD44（96.5%）表达阳性,CD34（3.0%）、CD45（2.6%）造血干细胞表型标志表达为阴性。向脂肪及成骨方向诱导培养21d,油红O染色、碱性磷酸酶染色、Von kossa染色均为强阳性,表明hUC-MSCs具有较强的多向分化潜能。基因转染48h后观察到较强的绿色荧光表达,Lenti-GFP-Sox9及Lenti-GFP的转染率均达到90%以上。RT-PCR、Western-blot检测到目的基因Sox9在hUC-MSCs中出现过表达（P<0.001）,细胞生长曲线显示转染对hUC-MSCs的增殖活力无明显影响（P>0.05）。Sox9基因修饰的hUC-MSCs在单层培养下7d开始出现自发性的细胞聚集现象,到14d细胞集聚明显增大,21d左右,有较大的软骨结节形成。而Lenti-GFP及未转染的细胞无明显的细胞集聚现象产生。RT-PCR、Western-blot、免疫组化及免疫荧光染色检测到Ⅱ型胶原、Agrrecan有较高水平的表达,阿利新兰染色示大量的蛋白多糖的在软骨结节中结聚。结论:1、成功构建了含有Sox9基因慢病毒载体。2、人脐带间充质干细胞体外培养扩增容易,具有多向分化潜能,易于被外源性基因修饰。2、在单层培养条件下,无生长因子及其他软骨诱导因子的刺激的情况下,经Sox9基因修饰的HU-MSCs具有较强的向软骨细胞分化的能力,表明Sox9基因在促进间充质干细胞向软骨细胞分化过程中发挥了重要的作用。
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标签：脐带间充质干细胞论文; 慢病毒载体论文; 基因论文; 基因转染论文; 软骨分化论文;