VEGF对低氧诱导肿瘤细胞耐药调控作用的研究

论文摘要

目的:低氧是实体瘤发生发展过程中存在的环境条件之一,是肿瘤发生恶性转化甚至转移的启动因子。低氧可以促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）的表达,也是肿瘤细胞对许多化疗药物产生耐药的重要原因之一。在这一基础上,本文研究了VEGF对低氧诱导肿瘤细胞产生耐受的作用,并进一步探讨了VEGF的中和抗体Anti-VEGF是否可以提高低氧环境中抗肿瘤药物依托泊苷（Etoposide）的药效作用进而改善缺氧肿瘤细胞对化疗药物的耐受性。方法:1)采用MTT法测定不同氧压条件下Etoposide在体外抑制人神经母细胞瘤细胞CHP126、人肺癌细胞A549及人肝癌细胞SMMC-7721的活性,绘制细胞生长抑制曲线。2)采用DAPI荧光染料染色观察Etoposide引起A549细胞的凋亡情况。3)采用PI染色结合流式细胞术测定Etoposide对CHP126、A549及SMMC-7721细胞的周期分布情况。4)采用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术测定Etoposide对CHP126、A549及SMMC-7721细胞的凋亡率。5)采用Western blotting法分别检测低氧及VEGF抗体对CHP126细胞相关蛋白的影响（Bax、Bcl-2、Procaspase 3、VEGF、p-ERK1/2、HIF-1α）,和常氧、低氧条件下Etoposide对A549及SMMC-7721细胞内凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Procaspase 9、Procaspase 3、PARP）、G2/M周期相关蛋白（Cyclin B1、Cde2、Cdk7）及HIF-1α、VEGF、Flt1、p53、ERK1/2和Akt等蛋白表达的影响。结果:1)低氧条件下CHP126细胞对Etoposide产生耐药。在常氧条件下,Etoposide对CHP126细胞表现出较强的体外增殖抑制能力,其在48 h和72 h的半数抑制浓度(IC50值)分别为0.78±0.09μM和0.24±0.02μM;而在低氧（3%O2）条件下Etoposide作用相同时间得到的IC50值均大于50μM。Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测结果显示,0.5μM的Etoposide在常氧下的CHP126细胞中作用0 h、24 h、48 h及72 h的凋亡率分别为5.48%、35.45%、63.78%及76.48%;而低氧（3%O2）条件下相同浓度的Etoposide作用上述时间后仅引起10%左右的细胞发生凋亡。2)VEGF在CHP126细胞的低氧耐受过程中发挥重要作用。Western blotting结果显示,CHP126细胞在低氧（3%O2）环境中处理0 h、12 h和24 h后,Bax/Bcl-2比值出现先升后降的变化;Procaspase 3蛋白则相应地先下调后上调;在这过程中VEGF则随时间发生稳定的累积。用外源性人重组内皮生长因子(rhVEGF165)处理后,CHP126细胞内的Bcl-2和Procaspase 3表达量均显著增加,这提示VEGF在细胞低氧适应及耐受过程中发挥了重要作用。rhVEGF165还可以刺激VEGF及HIF-1α的表达水平升高;而Anti-VEGF可以逆转这一作用。Western blotting检测结果还显示,在CHP126细胞株内不表达或弱表达Flt1,而在A549及SMMC-7721细胞中Flt1的表达量丰富。3)VEGF调控A549和SMMC-7721细胞内HIF-1α蛋白的表达。在A549和SMMC-7721细胞内,低氧作用1 h、2 h和4 h后,HIF-1α、VEGF和Flt1的蛋白表达均升高;Anti-VEGF使同等条件下这三个蛋白的表达均下降,rhVEGF165则可以进一步增加三者的含量。而与在CHP126细胞中的观察结果相似,Etoposide在低氧（0.6%O2）条件下对A549及SMMC-7721细胞分别作用48 h、72 h的生长抑制作用显著低于常氧条件,其抗肿瘤活性降低。4)Anti-VEGF与Etoposide联用不影响A549及SMMC-7721细胞的周期分布结果。采用PI单染结合流式细胞术检测到10μM的Etoposide在常氧、低氧（0.6%O2）条件下在A549细胞中作用48 h引起的G2/M期阻滞率分别为80.55%和38.39%;1.25μM的Etoposide在SMMC-7721细胞上则分别引起87.97%和58.65%的G2/M周期阻滞。而低氧（0.6%O2）条件下Anti-VEGF及rhVEGF165在两个细胞株中的预孵育所引起的细胞周期阻滞情况与Etoposide单用时相比,没有明显的变化。Western blotting法检测了G2/M期主要的调控蛋白,发现Etoposide作用后均可引起A549与SMMC-7721细胞内Cyclin B1显著的增加,而低氧（0.6%O2）下同浓度的Etoposide对该蛋白的累积能力明显下降。Anti-VEGF的预孵育不影响Cyclin B1、Cdc2、Cdk7的表达。5)Anti-VEGF与Etoposide联用促进低氧下SMMC-7721细胞的凋亡。DAPI染色证实,Etoposide在常氧条件下作用48 h可以诱导A549细胞发生显著的细胞核固缩。在低氧（0.6%O2）条件下,未观察到明显的核变化;加入Anti-VEGF预处理不影响DAPI染色的结果。Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测结果则显示,常氧环境中1.25μM的Etoposide作用于SMMC-7721细胞0 h和48 h的凋亡率分别为8.10%和18.75%,而Etoposide与Anti-VEGF或rhVEGF165的共孵育引起的凋亡率分别为19.20%和16.43%;低氧（0.6%O2）环境中上述给药方式相应的凋亡诱导率分别为6.87%、12.64%、23.86%和18.13%,显示Anti-VEGF与Etoposide的联用可以明显地逆转SMMC-7721细胞内低氧相关的Etoposide耐受情况。Western blotting结果表明低氧（0.6%O2）条件下Anti-VEGF预处理组SMMC-7721细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2表达出现进一步的下调,caspase 9出现活化片段,Procaspase 3也出现下调并促使PARP产生裂解片段,表明激活了凋亡通路。6)Anti-VEGF发挥作用可能与p53的有效积累相关。Etoposide在常氧下作用于A549及SMMC-7721细胞均能促进p53蛋白表达量的累积。而仅在SMMC-7721细胞内,Anti-VEGF和Etoposide合用可以刺激低氧（0.6%O2）条件下p53的重新积聚。Akt及ERK1/2通路在低氧介导的Etoposide耐受中均发挥作用。Anti-VEGF预处理在低氧（0.6%O2）条件下对Akt及ERK1/2信号途径均没有明显影响。结论:VEGF在神经母细胞瘤CHP126细胞的低氧耐受中起到了非常重要的作用。在VEGF受体Flt1高表达的人肺癌细胞A549及人肝癌细胞SMMC-7721内,低氧诱导产生HIF-1α、VEGF及Flt1的表达;而VEGF的累积则可以进一步增加HIF-1α和Flt1的表达。同时,我们发现Anti-VEGF能有效抑制低氧下HIF-1α的蛋白表达水平,并可通过影响细胞凋亡进程（而非细胞周期分布）逆转Etoposide在SMMC-7721中的低氧耐受情况。但这一现象并未在A549细胞中被观察到,这可能与与p53能否有效地招募或积聚有关。上述实验结果为抗VEGF策略在临床的肿瘤个性化治疗方案提供了一定的理论基础和指导意义。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目次
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 药物与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 细胞培养
• 2.4 MTT法检测细胞毒性
• 2.5 DAPI染色法检测细胞形态学变化
• 2.6 流式细胞术检测细胞周期分布
• 2.7 流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.8 Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白
• 3 实验结果
• 3.1 VEGF调控低氧介导的肿瘤细胞耐药
• 3.2 低氧诱导肿瘤细胞产生Etoposide耐药
• 3.3 Anti-VEGF对肿瘤细胞低氧耐药的影响
• 4 讨论与展望
• 参考文献
• 综述
• 硕士期间已发表的论文、综述及会议摘要
• 作者简历