论文摘要
肿瘤是危害人类健康的重大疾病,现已成为我国城市与农村居民首位的死亡原因。目前,国际上对肿瘤发生分子机制的基础研究主要集中在肿瘤相关基因的克隆和功能分析、细胞信号传导通路以及细胞周期调控等领域。胸苷酸合成酶（thymidylate synthase,TS）是一种叶酸依赖性生物酶,在生物体内催化2’-脱氧尿苷-5’-一磷酸（2’-deoxyuridine-5’-monophosphate,dUMP）甲基化形成2’-脱氧胸苷-5’-一磷酸（2’-deoxythymidine-5’-monophosphate,dTMP）,其中,5,10-亚甲基四氢叶酸（CH2-THF）是甲基供体,形成7,8-二氢叶酸,dTMP进一步磷酸化后生成脱氧胸苷三磷酸（dTTP）,该反应是dTMP从头合成的关键步骤。TS是DNA合成的限速酶,在细胞分裂和增殖中起重要作用,它也因此成为重要的肿瘤化学治疗靶酶。以前的研究表明,TS不仅具有酶催化活性,而且具有RNA结合活性,可通过与自身的mRNA结合来抑制自身的翻译过程。而且,TS还能与其它癌症相关基因如p53、c-myc、bcl-2的mRNA结合。越来越多的证据表明,TS不仅调控自身蛋白的表达,也影响调控细胞周期的其它相关蛋白的合成,在DNA修复和转录中起重要作用。TS的表达与肿瘤的化疗疗效密切相关,探讨TS的表达调控机制,将有助于我们发现抗肿瘤新药和更好地阐明肿瘤细胞抗药性机理。前人采用人癌细胞模型证明TS的翻译调控与药物的抗药性具有密切关系,但对其在人体内以及动物体内的调控机制所知甚少。斑马鱼（zebrafish,Danio rerio）是适合研究遗传学、胚胎学、发育学和细胞学的脊椎类模式生物。斑马鱼胚胎具有容易喂养、易于药物处理、生长周期短和胚胎透明可以观察到内部细胞、组织和器官变化等特点。近年来,斑马鱼胚胎已应用到药物的筛选和评价领域。前期的研究表明斑马鱼TS的基因序列和蛋白质结构都与人具有高度的相似性,斑马鱼TS的氨基酸序列与人的TS同源性达到76%,蛋白活性域的同源性达到95%以上。斑马鱼和人的TS有相同的dUMP结合位点,而且叶酸结合位点也有极高的同源性,由此可推断,斑马鱼TS基因调控方式可能与人的相类似。本研究中,我们采用凝胶迁移、免疫共沉淀:RT-PCR、Western Blotting、Northern Blotting和体外翻译抑制等技术,对斑马鱼TS的表达、转录和翻译水平上的表达调控等进行了探讨,研究结果显示,在斑马鱼中TS的表达调控与人和大肠杆菌中的相同,斑马鱼有望成为筛选TS抑制类药物的理想动物模型。本研究首先对斑马鱼TS蛋白进行了体外原核表达,利用含斑马鱼TS表达质粒pET28a/ZF-TS的大肠杆菌BL21（DE3）,在培养基中加入IPTG,诱导表达3h,斑马鱼TS重组蛋白表达量可达总蛋白含量的35%;并进一步利用镍离子柱,在活性条件下,把斑马鱼TS蛋白从总蛋白中分离纯化出来,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果显示,得到的TS蛋白具有高度的均一性。为了揭示在体外条件下,斑马鱼TS蛋白与斑马鱼TS RNA的作用规律,我们利用重组TS蛋白和地高辛标记的全长TS mRNA探针,进行了凝胶阻滞（EMSA）实验。结果显示,TS具有RNA结合活性,用100倍非标记探针进行的竞争试验也说明在体外条件下,TS蛋白能与自身的RNA结合。进一步的紫外交联试验显示,蛋白和RNA杂交带的大小约80kDa,说明蛋白与RNA发生了结合,而且蛋白是以二聚体的形式与RNA相互作用,不是由单个蛋白分子引发结合反应。我们以斑马鱼胚胎为试验材料,利用免疫共沉淀:RT-PCR技术研究了斑马鱼TS蛋白与斑马鱼TS mRNA在生物体内的作用规律。结果显示,鼠抗人的单克隆抗体TS106可以免疫沉淀斑马鱼的TS蛋白。在免疫共沉淀的复合物中,去除蛋白后,分别用扩增斑马鱼TS和c-myc基因编码序列的引物,进行RT-PCR,结果显示沉淀复合物中含有TS和c-myc RNA,说明在体内条件下,斑马鱼TS蛋白与其自身mRNA能相互作用。用5-FU处理1-2细胞期斑马鱼胚胎,Western Blotting分析5-FU对斑马鱼TS蛋白表达量的影响,结果表明,5-FU能显著增加胚胎细胞中的TS蛋白含量;而Northern Blotting分析结果显示5-FU对斑马鱼TS mRNA水平没有影响。在兔网织红细胞体外翻译体系中,加入5-FU,TS mRNA的翻译效率没有明显的变化,但加入5-FdUMP,随着浓度的增大,翻译效率明显降低,表现出翻译抑制现象。由此,我们推断,在斑马鱼中氟脲嘧啶类药物引发的TS蛋白水平的升高是发生在翻译水平上,而不是转录水平上,这可能是5-FU引发细胞耐药性的原因之一。我们的研究表明,在体外和体内条件下,斑马鱼TS蛋白都能与其自身mRNA相互作用,氟嘧啶类TS抑制剂5-氟尿嘧啶影响斑马鱼TS的翻译调控,进一步阐明了斑马鱼相应生物学过程与人的相关性,并首次在整体动物水平上揭示了肿瘤细胞对氟尿嘧啶类药物的耐药成因。本工作对肿瘤耐药机理的研究具有重要价值,为建立以TS为靶点的斑马鱼抗肿瘤药物研究模型奠定了基础。