重组蛋白包涵体变复性过程优化及折叠机制探索

论文摘要

大肠杆菌表达系统作为常用的外源蛋白表达系统,其表达的重组蛋白大多数以无活性的包涵体形式存在。对包涵体蛋白进行变性去折叠,再通过复性重折叠为具有天然构象的活性蛋白仍然是普遍存在的技术难点。本研究主要运用我们开发的包涵体双变性复性技术,对增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）、巨噬细胞金属弹性蛋白酶催化区域（Matrix Metal Proteinases-12 Catalytic Domain, MMP12）、神经元限制性沉默因子/抑制元素1沉默转录因子蛋白的DNA结合结构域（NRSF/REST DNA Binding Domain,DBD）三种重组蛋白包涵体进行变复性过程优化研究。其中,对三种蛋白的变性去折叠过程均采用7M盐酸胍为第一变性剂,梯度稀释法沉淀目的蛋白,8M脲素作为第二变性剂溶解沉淀的目标蛋白；采用快速稀释法对EGFP变性蛋白进行复性,双变复性后的EGFP活性回收率比单变复性高33.8%。采用等容梯度透析复性法对MPP-12变性蛋白进行复性过程优化,从一升LB培养基培养的菌体中所得到MMP-12纯品量是文献报道的单变复性方法的两倍,且具有相当的生物活性。采用单变复性方法不能使DBD蛋白正确再折叠复性,在复性过程中蛋白大量聚集；而采用双变性和梯度透析复性法对DBD进行复性过程优化,从一升LB培养基培养的菌体中可以得到7mg纯度大于90%的DBD,首次成功获得该蛋白的可溶性制备；凝胶迁移实验证明复性后的DBD能和不同浓度的双链DNA结合,具有DNA结合活性。此外,为了探究MMP-12在等容梯度透析复性时的折叠机制,本研究采用核磁共振、内源性色氨酸荧光光谱、圆二色谱、外源性ANS荧光探针四种方法监控MMP-12变性蛋白的再折叠过程。核磁共振和圆二色谱、内源性色氨酸荧光光谱及ANS荧光探针法得到的再折叠中点值时对应的脲素浓度几乎相等（Cm≈4）。从不同脲素浓度中MMP-12的HSQC谱图得知,当脲素浓度大于4M时,信号明显聚集,且化学位移值变化较小；脲素浓度小于3M时,信号大量增多且比较发散,证明MMP-12再折叠过程中没有折叠中间体形成,属于高度协同的二态模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 包涵体形成及定义
• 1.1.1 包涵体的形成
• 1.1.2 包涵体的定义
• 1.1.3 包涵体的形成机制
• 1.2 常规的包涵体单变复性操作
• 1.2.1 包涵体的提取
• 1.2.2 包涵体的溶解
• 1.2.3 包涵体的复性
• 1.3 包涵体双变复性研究基础
• 1.3.1 包涵体双变复性操作流程
• 1.3.2 包涵体双变复性应用及数据分析
• 1.4 蛋白质折叠机制研究
• 1.4.1 蛋白质折叠理论基础
• 1.4.2 蛋白质折叠监控常用方法
• 第二章 增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）变复性过程优化
• 2.1 GFP介绍
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 菌株与序列
• 2.2.4 EGFP的表达
• 2.2.5 EGFP包涵体双变复性流程
• 2.2.6 EGFP包涵体单变复性流程
• 2.2.7 EGFP纯化过程
• 2.2.8 EGFP荧光检测
• 2.3 结果与讨论
• 第三章 神经元限制性沉默因子/抑制元素1沉默转录因子蛋白的DNA结合结构域（NRSF/REST DNA Binding Domain,DBD）变复性过程优化
• 3.1 DBD介绍
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 菌株与序列
• 3.2.4 包涵体双变复性过程
• 3.2.5 DBD纯化方法
• 3.3 结果与讨论
• 第四章 巨噬细胞金属弹性蛋白酶催化区域（Matrix Metal Proteinases-12,MMP-12）变复性过程优化
• 4.1 MMPs（Matrix Metal Proteinases）介绍
• 4.1.1 金属基质蛋白酶
• 4.1.2 MMP-12介绍
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 菌株与序列
• 4.2.4 MMP-12包涵体表达
• 4.2.5 MMP-12包涵体双变复性流程
• 4.2.6 MMP-12纯化过程
• 4.2.7 MMP-12酶活测定实验
• 4.3 结果与讨论
• 第五章 MMP-12再折叠过程监控
• 5.1 蛋白质折叠监控常用方法
• 5.1.1 NMR监控蛋白质折叠理论基础
• 5.1.2 荧光法的理论基础
• 5.1.3 圆二色光谱（Circular dichroism简称CD）理论基础
• 5.1.4 ANS荧光探针法的理论基础
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 仪器
• 15N标记的MMP-12的HSQC谱图采集'>5.2.3¹⁵N标记的MMP-12的HSQC谱图采集
• 5.2.4 色氨酸荧光光谱法
• 5.2.5 圆二色光谱测定
• 5.2.6 ANS结合实验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 HSQC谱图
• 5.3.2 色氨酸荧光吸收结果
• 5.3.3 圆二色光谱测定结果
• 5.3.4 ANS荧光探针实验
• 第六章 论文总结
• 展望
• 参考文献
• 致谢