南极中度嗜盐菌盐单胞菌Nj223四氢嘧啶生物合成基因ectABC的克隆及其功能初步研究

论文摘要

南极普里兹湾特定的地理环境和海底地形特点,能够长久保持高盐、低温、高海水密度等特点,其海底沉积物的微生物往往具有适应特殊环境的生理学上的特异性。其特定的生态环境蕴藏着独特而又极其丰富的微生物资源,其中大部分还鲜为人知,这为研究中度嗜盐菌盐适应机制开辟了一个崭新的平台。对普里兹湾深海沉积物中筛选到的中度嗜盐菌盐单胞菌Nj223（Halomonas sp. Nj223）进行分类鉴定并分析其主要累积的相容性溶质种类及浓度。Nj223主要累积相容性溶质为四氢嘧啶（ectoine）,其次是谷氨酸（Glutamate）。根据四氢嘧啶合成基因ectABC的蛋白氨基酸的保守序列,设计了多对引物,以该菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经过序列测定和Blast分析,确定其为ectABC基因的部分序列。经过多次PCR和反向PCR,最终获得了一个全长2826bp的DNA片段。初步分析该片段含有编码四氢嘧啶生物合成途径中的三个酶的基因,ectA、ectB、ectC及上下游序列。为了研究该基因簇的功能,构建含ectABC编码基因的重组质粒pET-28a（+）-ectABC,转化E.coli BL21（DE3）后得重组子pKS002,提取质粒,酶切,测序结果表明pKS002中重组质粒确实含有ectABC编码基因。观察到该重组子pKS002在基本培养基M63中耐盐能力得到提高。进一步分析,提取该重组子细胞内的相容性溶质,HPLC分离纯化后13C NMR检测到四氢嘧啶的波峰,说明了该菌株是由于合成了四氢嘧啶提高了其耐盐能力。对ectA、ectB、ectC进行克隆及诱导表达,分离纯化后得到四氢嘧啶生物合成途径中的三个重组蛋白酶,EctA,EctB和EctC。分别加入各自底物,测定酶活力来验证其反应方程式,从而在体外验证了该菌株四氢嘧啶生物合成途径。分析这三个重组蛋白酶发现,具有相似的酶学性质。四氢嘧啶在保护生物大分子上具有独特的功效,因此,我们研究了Nj223菌株分泌的四氢嘧啶对乳酸脱氢酶的保护作用,实验发现,四氢嘧啶能够明显增强乳酸脱氢酶的抗热、盐酸胍、冻干、冻融等不利因素的能力。实验还发现,四氢嘧啶具有使感受态细胞反复冻存后仍具有较高转化效率的能力。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 中度嗜盐菌概况
• 1.2 中度嗜盐菌的主要类群
• 1.3 中度嗜盐菌的生态分布
• 1.4 中度嗜盐菌的生理学特点
• 1.4.1 需盐性与耐盐性
• 1.4.2 对营养要求低
• 1.4.3 抗重金属毒害
• 1.4.4 细胞内可以累积无机盐离子
• 1.4.5 细胞膜中有离子泵
• 1.4.6 细胞内有相容性溶质及其转运系统
• 1.5 中度嗜盐菌的盐适应机制及渗透压调节
• 1.5.1 相容性溶质简介
• 1.5.2 相容性溶质的分类和生理功能
• 1.5.3 相容性溶质的合成与转运机制
• 1.5.4 相容性溶质作用机制
• +的排出'>1.5.5 Na⁺的排出
• 1.5.6 参与渗透压调节的蛋白
• 1.5.7 渗透压调节的基因工程研究进展
• 1.6 南极极端微生物研究进展
• 1.6.1 极端微生物简介
• 1.6.2 南极概况
• 1.6.3 南极普里兹湾生态环境研究进展
• 1.7 本论文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料、菌株和质粒
• 2.1.2 酶
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 其它试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 培养基的配制
• 2.1.7 缓冲液及其它常用溶液的配制
• 2.1.8 主要的分析软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 基本方法
• 2.2.2 菌株的筛选及鉴定
• 2.2.3 四氢嘧啶的分离纯化及其结构鉴定
• 2.2.4 ectABC 基因的克隆与测序
• 2.2.5 ectABC 基因的序列功能分析
• 2.2.6 ectA、ectB 和ectC 基因的重组表达及蛋白纯化
• 2.2.7 EctA、EctB 和EctC 的酶活测定
• 2.2.8 pH、金属离子和温度对EctA、EctB 及EctC 的影响
• 2.2.9 四氢嘧啶与其它相容性溶质对乳酸脱氢酶保护作用
• 2.2.10 四氢嘧啶对感受态细胞反复冻存后转化效率的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 ectABC 的功能分析
• 3.1.1 Nj223 菌株的分离鉴定
• 3.1.2 菌株Nj223 在高盐条件下主要累积的相容性溶质
• 3.1.3 ectABC 基因结构及功能分析
• 3.1.4 ectA、ectB 和ectC 的重组表达与纯化
• 3.1.5 EctA、EctB 和EctC 的酶学性质分析
• 3.2 四氢嘧啶的功能研究
• 3.2.1 四氢嘧啶对乳酸脱氢酶的保护效果
• 3.2.2 四氢嘧啶对感受态细胞反复冻存后转化效率的保护效果
• 4 讨论
• 5 小结与展望
• 已发表和待发表的文章
• 参考文献
• 致谢