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灵芝活性肽的保肝活性研究及其结构初探

2020-11-29阅读(373)

灵芝活性肽的保肝活性研究及其结构初探

论文摘要

目前国内外关于灵芝多糖及灵芝三萜类化合物的提取纯化与药理作用研究比较透彻,然而对灵芝肽（GLP）的研究却鲜有涉及;本室前期工作已对灵芝活性肽进行了初步分离,并证实其具有很好的抗氧化活性及对CCl4致肝损伤有很好的辅助保护作用。为了深入研究灵芝肽的保肝活性及其构效关系,本文对灵芝原料进行了选择,考察了8种树脂对灵芝肽的脱盐效果;通过体外试验、动物实验,探究了灵芝肽与灵芝多糖、灵芝三萜类化合物的协同抗氧化、保肝作用;分别采用了D-氨基半乳糖（D-GalN）、乙醇及卡介苗/脂多糖（BCG+LPS）三种急性肝损伤小鼠模型,进一步研究了灵芝肽的保肝作用;采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析法,考察了灵芝肽分子量分布;借助于RP-HPLC、HPLC-MS/MS等手段解析了一种灵芝肽结构,初步探讨了灵芝肽的结构与其活性的关系。1.灵芝原料的选择、灵芝肽的提取与脱盐（1）比较了灵芝子实体粉、两种灵芝菌丝体粉、赤芝子实体菌盖及菌柄水提液的粗蛋白含量和抑制羟基自由基活性,结果显示:灵芝子实体粉与灵芝菌丝体粉1的粗蛋白质含量及对羟基自由基的抑制率基本相当,其粗蛋白质含量虽不及灵芝菌丝体粉2,但与灵芝菌丝体粉2比较,其对羟基自由基的抑制率的差异相对较小;由于灵芝菌丝体粉1已商品化,经综合考虑,选择了灵芝菌丝体粉1作为本实验的原料。（2）灵芝水提液超滤后经Cu2+-Sephadex G-25配位色谱法分离后得到两个肽峰,是两组复合肽。（3）比较S-8、XAD-16、DA201-C、NAK-Ⅱ、D4020、AB-8六种大孔树脂的静态吸附率、脱盐率及静态解吸附效果,结果显示:S-8树脂对灵芝肽的吸附率及在70%乙醇中的解吸附率均最大,但是DA201-C树脂的脱盐率最高,且其吸附与解吸附效果也接近于S-8树脂,因此选择DA201-C树脂进行了动态吸附的正交试验,确定了最佳的吸附条件为:上样流速为1.6 mL/min、pH值为5.5、上样浓度为2.0mg/mL;比较经大孔树脂（S-8树脂和DA201-C树脂）和阴、阳离子交换树脂处理的两种脱盐方法,结果显示:大孔树脂的脱盐效果优于阴、阳离子交换树脂;而大孔树脂DA201-C与S-8相比较,虽然后者的氮回收率稍高,但其·OH抑制活性和脱盐率均不如前者。经综合考虑,宜选用大孔树脂DA201-C作为灵芝肽脱盐的柱材料。2.灵芝肽对三种肝损伤模型的保肝作用（1）与D-GalN肝损伤模型组小鼠比较,当灌胃中（120mg/kg·bw）、高剂量（180mg/kg·bw）GLP时,能显著（p＜0.05）或极显著（p＜0.01）地降低小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性,同时也能显著地抑制肝匀浆中谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力的下降及丙二醛（MDA）含量的升高（p＜0.01）;生化指标测定及病理学观察均显示出明显的剂量-效应关系,高剂量给肽组小鼠肝细胞病变明显好转或恢复。（2）急性酒精性肝损伤模型的生化指标变化明显,而肝组织病理学变化不明显。模型组的ALT、AST、TG、GSH、MDA、SOD等指标与对照组相比,均发生了显著变化,说明造模是成功的。与乙醇肝损伤模型组小鼠比较,当灌胃低（60mg/kg·bw）、中（120mg/kg·bw）、高剂量（180mg/kg·bw）GLP时,均能极显著地降低血清AST/ALT的活性和TG的含量（p＜0.01）,可极显著地拮抗小鼠肝匀浆中GSH含量与SOD活力的下降与MDA的产生（p＜0.01）,并极显著地抑制肝、脾指数的增大（p＜0.01）;肝组织病理学观察显示:高剂量给肽组小鼠肝细胞与正常组小鼠肝细胞基本相同。中剂量组的效果与阳性对照药物硫普罗宁组（50mg/kg·bw）相当,其中尤以高剂量灵芝肽的保肝作用明显。（3）与BCG+LPS致肝损伤模型组小鼠比较,当灌胃中（120mg/kg·bw）、高剂量（180 mg/kg·bw）GLP时,能显著（p＜0.05）或极显著（p＜0.01）降低小鼠血清中ALT、AST活性以及肝、脾指数,同时也能显著地抑制肝匀浆中GSH含量、GSH-Px/SOD活力的下降（p＜0.01）及MDA与NO含量的升高;生化指标测定及病理学观察均显示出明显的剂量-效应关系,高剂量组的各项实验结果均趋近于正常组,某些生化指标甚至好于正常组。总之,灵芝肽灌胃剂量为180 mg/kg·bw时,对D-氨基半乳糖（D-GalN）、乙醇及卡介苗加脂多糖（BCG+LPS）三种急性肝损伤小鼠模型均有很好的保护作用。3.灵芝肽、多糖、三萜类化合物及其协同抗氧化、保肝作用研究（1）当浓度为7.5mg/mL GLP与浓度为25mg/mL的灵芝多糖（GLPS）组合时,其抑制羟基自由基效果比优于单组分的作用效果,但尚未达到协同增效效果。（2）当GLP与GLPS组合时,无论有无自由基诱导剂,组合组抑制小鼠体外肝匀浆中MDA生成的效果均优于单组分组;当浓度为12.5mg/mL的GLPS与三种剂量的GLP组合时,均呈现出了协同增效效果。（3）在D-GalN肝损伤模型实验中,GLP（150mg/kg·bw）、GLPS（800mg/kg·bw）、灵芝三萜类化合物（GLT）（100mg/kg·bw）及三者组合,均能极显著降低小鼠血清中ALT、AST活性,同时也能极显著地抑制肝匀浆中SOD/GSH-Px活性、GSH含量的下降及MDA含量的升高（p＜0.01）;但生化指标除GSH外,三者组合组均未显示出明显的协同增效作用;但三者组合组小鼠肝细胞病变明显好转或恢复,效果好于单组分组。4.灵芝肽分子量分布及灵芝肽结构初探GLP经葡聚糖凝胶G-15层析分离,出现2个吸收峰,峰1组分的分子量范围在5398.8-1148.9Da之间;峰2组分的分子量范围在1148.9-52.0Da之间,峰2主要洗脱物的分子量范围为530.0-244.5Da;采用HPLC、MS、MS/MS对与HPLC图中主峰Ⅰ对应的,M/Z为365.1的质谱峰进行结构解析,该化合物是氨基酸序列为Ser-Asp-Gly-Ser四肽。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语表
  • 第一章 绪论
  • 1.1 国内外关于灵芝的研究概况
  • 1.2 国内外关于生物活性肽的研究概况
  • 1.3 国内外关于天然保肝物研究现状
  • 1.4 本研究的目的及意义
  • 第二章 灵芝活性肽的原料选择及脱盐
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 实验方法
  • 2.1.2.1 粗蛋白的测定
  • 2.1.2.2 各原料水浸提物对·OH自由基的抑制率
  • 2.1.2.3 灵芝菌丝体粉的水提取与超滤分离
  • 2.1.2.4 葡聚糖凝胶配位色谱法分离灵芝肽
  • 2.1.2.5 灵芝肽的脱盐
  • 2.1.2.6 几种脱盐材料的脱盐效果比较
  • 2.1.2.7 肽浓度的测定
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 原料的选择
  • 2.2.2 灵芝肽的分离
  • 2.2.3 灵芝肽的脱盐
  • 2.2.3.1 静态吸附
  • 2.2.3.2 静态解吸附
  • 2.2.3.3 DA201-C树脂动态脱盐条件的选择
  • 2.2.3.4 大孔树脂DA201-C动态吸附上样量的确定
  • 2.2.3.5 不同浓度洗脱液中肽的洗脱率
  • 2.2.3.6 几种脱盐材料脱盐效果的比较
  • 2.3 结论
  • 第三章 灵芝肽的保肝活性研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.1.1 原料
  • 3.1.1.2 主要试剂
  • 3.1.1.3 主要仪器
  • 3.1.1.4 实验动物
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.1.2.1 灵芝肽的制备
  • 3.1.2.2 灵芝肽对D-半乳糖胺致肝损伤的保护作用
  • 3.1.2.3 灵芝肽对乙醇致肝损伤的保护作用
  • 3.1.2.4 灵芝肽对卡介苗加脂多糖致肝损伤的保护作用
  • 3.1.2.5 小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）的测定
  • 3.1.2.6 小鼠血清中谷草转氨酶（AST）的测定
  • 3.1.2.7 小鼠血清中甘油三酯（TG）的测定
  • 3.1.2.8 小鼠肝匀浆中蛋白质含量的测定
  • 3.1.2.9 小鼠肝匀浆中丙二醛（MDA）含量的测定
  • 3.1.2.10 小鼠肝匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）的测定
  • 3.1.2.11 小鼠肝匀浆中还原型谷胱甘肽（GSH）的测定
  • 3.1.2.12 小鼠肝匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）的测定
  • 3.1.2.13 小鼠肝匀浆中一氧化氮（NO）含量的测定
  • 3.1.2.14 小鼠脏器指数的测定
  • 3.1.2.15 肝组织病理学检测
  • 3.1.2.16 统计学分析
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 灵芝肽对D-半乳糖胺肝损伤的保护作用
  • 3.2.1.1 GLP对D-GalN致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响
  • 3.2.1.2 GLP对D-GalN致肝损伤小鼠肝匀浆中SOD活性和MDA、GSH含量的影响
  • 3.2.1.3 肝脏组织病理学检查
  • 3.2.2 灵芝肽对乙醇肝损伤的保护作用
  • 3.2.2.1 GLP对乙醇致肝损伤小鼠肝脏、脾脏指数的影响
  • 3.2.2.2 GLP对乙醇致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响
  • 3.2.2.3 GLP对乙醇致肝损伤小鼠肝组织中SOD活性和MDA、GSH含量的影响
  • 3.2.2.4 肝脏组织病理学检查
  • 3.2.3 灵芝肽对卡介苗加脂多糖诱导免疫性肝损伤的保护作用
  • 3.2.3.1 GLP对BCG+LPS致肝损伤小鼠肝脏、脾脏指数的影响
  • 3.2.3.2 GLP对BCG+LPS致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响
  • 3.2.3.3 GLP对BCG+LPS致肝损伤小鼠肝组织中SOD、GSH-Px活性和MDA、GSH、NO含量的影响
  • 3.2.3.4 肝组织病理学检查
  • 3.3 讨论
  • 3.4 结论
  • 第四章 灵芝中肽与多糖、三萜类化合物协同抗氧化、保肝作用研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.1.1 原料
  • 4.1.1.2 主要试剂
  • 4.1.1.3 主要仪器
  • 4.1.1.4 实验动物
  • 4.1.2 方法
  • 4.1.2.1 灵芝肽的提取
  • 4.1.2.2 灵芝粗多糖的提取
  • 4.1.2.3 灵芝三萜类化合物的提取
  • 4.1.2.4 灵芝肽与灵芝多糖组合的抗氧化作用
  • 4.1.2.5 灵芝中肽、多糖及三萜类化合物组合对D-半乳糖胺致肝损伤的保护作用
  • 4.1.2.6 统计学分析
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 灵芝肽与灵芝多糖组合的抗氧化作用
  • 4.2.1.1 灵芝肽与灵芝多糖组合对·OH的抑制作用
  • 4.2.1.2 灵芝肽与灵芝多糖组合对小鼠肝组织中MDA生成的影响
  • 2O2诱导小鼠肝组织中MDA生成的影响'>4.2.1.3 灵芝肽与灵芝多糖组合对H2O2诱导小鼠肝组织中MDA生成的影响
  • 4.2.2 灵芝肽与灵芝多糖、三萜类化合物组合对D-半乳糖胺肝损伤的保护作用
  • 4.2.2.1 GLP、GLPS、GLT及三者组合对D-GalN致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响
  • 4.2.2.2 GLP、GLPS、GLT及三者组合对D-GalN致肝损伤小鼠肝组织中SOD、GSH-Px活性和MDA、GSH含量的影响
  • 4.2.2.3 肝组织病理学检查
  • 4.3 讨论
  • 4.3.1 GLP、GLPS及其组合的抗氧化作用
  • 4.3.2 GLT、GLP、GLPS及其组合的保肝作用
  • 4.4 结论
  • 第五章 灵芝肽的分子量分布与结构初探
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 实验方法
  • 5.1.2.1 分子量标准曲线的绘制及灵芝活性肽分子量分布的测定
  • 5.1.2.2 RP-HPLC分离纯化灵芝活性肽
  • 5.1.2.3 HPLC/MS分析
  • 5.2 结果与讨论
  • 5.2.1 灵芝肽分子量分布研究
  • 5.2.1.1 标准曲线的制作
  • 5.2.1.2 灵芝肽的分子量分布
  • 5.2.2 灵芝肽的HPLC、MS、MS/MS分析
  • 5.3 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录 （硕士期间发表的论文）

    • 相关论文文献

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