稻瘟菌激活蛋白基因克隆及功能解析

论文摘要

激活蛋白（Activator Protein）是从多种病原真菌中分离出的具有诱导植物抗病性、增强抗逆能力、促进植物生长等生物活性的蛋白激发子。目前对激活蛋白其理化性质、作用机理、活性测定等理论研究方面还比较薄弱。本研究以稻瘟菌为实验材料,首次建立了从稻瘟病菌中分离激活蛋白的技术路线和方法,并对激活蛋白进行了多项生物功能测定:利用抑制性消减杂交技术成功构建了植物激活蛋白处理水稻与非处理组水稻中差异表达的消减cDNA文库;克隆了稻瘟菌激活蛋白基因,首次获得了稳定表达可溶性稻瘟菌激活蛋白的菌株,并确定了表达蛋白的活性,该研究为确定激活蛋白的结构与功能及理化性质奠定基础。建立了分离纯化激活蛋白的技术路线和方法。激活蛋白粗提液经Hitrap Q FF离子交换柱层析和HitrapSuperdex 75分子筛层析纯化,即可得到40KDa、pI为4.7、不含糖基的单一蛋白。质谱测序结果共获得12个肽段的氨基酸序列,检索比对发现与GenBank中ID为EAA52615的推测蛋白具有100%的序列相似性,序列覆盖率达50.7%。通过一系列活性测定,确定稻瘟菌激活蛋白具有广谱生物活性。用纯化后的稻瘟菌激活蛋白处理植物可明显提高丝瓜、番茄等发芽率;同时具有促进植物幼苗生长的作用;还能增强植物抗病性,对番茄灰霉病的防效达到44%,对水稻稻瘟菌的防效达到50.68%;另外,还能提高水稻的抗旱性,抗旱综合指数从55提高到92。经激活蛋白处理后,纤维素酶和醇脱氢酶活性增强,过氧化氢和脯氨酸的含量也明显提高,这些酶和活性物质与植物生长及抗逆方面有关。构建了差异表达的消减cDNA文库,并获得28个上升表达差异基因。本研究通过双向电泳和反相色谱发现激活蛋白处理水稻后,水稻幼叶中的部分蛋白表达发生明显改变,其中部分亲水性蛋白表达量降低,而部分疏水性蛋白表达量增加。为探明这种变化,本文利用抑制性消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）成功构建了植物激活蛋白处理水稻与非处理组水稻中差异表达的消减cDNA文库。从文库中筛选到1756个克隆,通过反向Southern杂交,选取264个有效克隆并测序,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对分析,获得28个上升表达差异基因,这些基因与植物的光合作用、营养物质的运输代谢等多种植物的生理生化功能相关。从稻瘟菌中克隆了激活蛋白基因并在E.coli中表达,首次确定其促生长的生物功能。从稻瘟菌北1-24、CH353、CH363、CH369中分别扩增获得激活蛋白基因组DNA,它们之间的序列完全一致,但与GenBank数据库中的稻瘟菌全基因序列有两处不同:一处是在内含子范围内的ACAC序列,另一处是在外显子范围内的G碱基。通过反复测序,确定实验获得的稻瘟菌北1-24的序列是正确的。通过磁珠PCR法,扩增稻瘟菌总cDNA,并从中获得稻瘟菌激活蛋白的cDNA序列。经过反复筛选载体和菌株,改造构建载体pET22b-GST,获得可稳定表达可溶性稻瘟菌激活蛋白的菌株,确定了表达蛋白具有生物活性。

论文目录

第一章引言

1 蛋白激发子

1.1 激发子定义及概要

1.2 蛋白激发子种类及其在国内外研究进展

2 差异蛋白与差异基因筛选方法

2.1 差异蛋白常用筛选方法

2.2 差异基因常用筛选方法

3 研究目的与意义

第二章稻瘟菌激活蛋白的纯化及其理化性质分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

1.2.1 稻瘟菌生长曲线测定

1.2.2 稻瘟菌激活蛋白的提纯

1.2.3 样品的制备及电泳

1.2.4 蛋白质氨基酸序列测定

1.2.5 蛋白质等电点的测定

1.2.6 蛋白质糖基化检测

1.2.7 烟草愈伤组织和悬浮细胞的获得

1.2.8 对烟草悬浮细胞过氧化氢含量的影响

2 结果与分析

2.1 稻瘟菌生长曲线测定

2.2 烟草愈伤组织和悬浮细胞的获得

2.3 稻瘟菌植物激活蛋白的分离纯化及检测

2.4 蛋白氨基酸序列测定

2.5 蛋白等电点的测定

2.6 蛋白糖基化检测

3.小结与讨论

第三章稻瘟菌激活蛋白的生物学活性及功能分析

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

1.2.1 稻瘟菌激活蛋白的制备与浓度测定

1.2.2 激活蛋白对番茄和丝瓜发芽的影响

1.2.3 激活蛋白对植株生长的影响

1.2.4 激活蛋白对番茄、水稻抗性的诱导作用

1.2.5 激活蛋白对黄瓜、豌豆幼苗及烟草悬浮细胞纤维素酶的影响

1.2.6 激活蛋白对烟草悬浮细胞过氧化氢含量的影响

1.2.7 激活蛋白对水稻幼苗脯氨酸含量的影响

1.2.8 激活蛋白对碗豆幼苗醇脱氢酶活性的影响

2 结果与分析

2.1 激活蛋白对植物丝瓜、番茄发芽的影响

2.2 激活蛋白对植物豌豆和水稻幼苗生长的促进作用

2.3 激活蛋白对水稻抗病性及抗旱性的诱导作用

2.4 激活蛋白对黄瓜、豌豆幼苗及烟草悬浮细胞纤维素酶的影响

2.5 激活蛋白对水稻幼苗脯氨酸含量的影响

2.6 激活蛋白对碗豆幼苗醇脱氢酶活性的影响

2.7 激活蛋白对烟草悬浮细胞过氧化氢含量的影响

3.小结与讨论

第四章稻瘟菌激活蛋白激发水稻基因的差异表达

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

1.2.1 水稻样品的处理

1.2.2 蛋白质双向电泳

1.2.3 高效液相色谱

1.2.4 水稻总RNA的提取

1.2.5 mRNA的纯化

1.2.6 SSH文库的构建

1.2.7 Southern Blotting检测

1.2.8 阳性克隆测序及结果分析

2 结果与分析

2.1 水稻样品的处理

2.2 总蛋白分析

2.2.1 蛋白质双向电泳

2.2.2 溶解蛋白高效液相色谱分析

2.3 水稻总RNA与mRNA的提取与检测

2.4 SSH文库的构建

2.4.1 Rsa I 酶切及接头效率的检测

2.4.2 差减杂交PCR产物分析

2.4.3 插入片段检测

2.4.4 地高辛杂交检测

2.4.5 阳性克隆测序及生物信息学分析

3 小结与讨论

3.1 双向电泳

3.2 高效液相

3.3 SSH文库在水稻基因差异表达研究中的优越性及注意事项

3.4 激活蛋白诱导的水稻差异表达基因

第五章稻瘟菌激活蛋白基因的克隆与表达

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

1.2.2 稻瘟菌激活蛋白基因组DNA的克隆及鉴定

1.2.3 稻瘟菌RNA的提取

1.2.4 用磁珠PCR法获得稻瘟菌总cDNA

1.2.5 从稻瘟菌总cDNA中扩增目的基因并克隆检测

1.2.6 酵母双杂交自激活检测

1.2.7 原核表达

2 结果与分析

2.1 稻瘟菌激活蛋白基因组DNA的克隆及鉴定

2.2 稻瘟菌激活蛋白cDNA的克隆及鉴定

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 用磁珠和PCR方法从少量RNA获得cDNA

2.2.3 稻瘟菌激活蛋白基因的克隆及序列分析

2.3 利用pET22b（+）进行表达载体的构建与表达

2.4 利用pTWIN1进行表达载体的构建与表达

2.5 利用pGEX-5X-1进行表达载体的构建与表达

2.6 对载体pET22b（+）的改造与表达

2.7 表达蛋白活性测定

2.8 酵母双杂交自激活检测

3.小结与讨论

3.1 扩增的基因

3.2 cDNA的扩增

3.3 稻瘟菌激活蛋白表达

总结

参考文献

致谢

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