批量烟蒂STR检验方法建立及应用研究

论文摘要

DNA证据已成为法庭科学揭示罪犯、认定嫌疑、定罪量刑最有效的技术手段之一。犯罪分子反侦察手段日益狡猾,指纹等运用时间较久的痕迹物证常被有意识地销毁和破坏。随着DNA检验技术的逐步成熟与基层现场勘察人员对DNA检验技术认识的加深,DNA检验技术在刑事案件中的运用进一步广泛。除了凶杀案、强奸案等大要及疑难案件外,在多发性案件尤其是盗窃案中,DNA检验技术也开始发挥越来越重要的作用。特别是烟蒂,作为常见的脱落细胞生物检材,由于提取方便、包装简单、检验结果也较好,得到现场勘察人员的青睐,统计广州市公安局番禺区分局2008至2012年盗窃案现场的物证提取,其中提取到烟蒂的案例占总案例数的60%。同时其他来自人体的脱落细胞类检材,由于常易被忽视或根本无法消除,在法医实际工作中,90%以上的案件遇到脱落细胞类痕量生物检材。除了部分检材现有检验技术无法得出有效STR分型等原因外,DNA实验室人力资源的紧缺与检验水平的个体差异也逐步浮上水面。如何走出不同载体脱落细胞分类手工提取的负累,走出脱落细胞类生物检材提取速度的瓶颈,提高脱落细胞类生物检材的检验效率；同时减少人为因素的干预,达到规范化、标准化的要求,成为了DNA发展的另一个主要突破点。案件较多的DNA实验室对使用自动化的工作平台结合商品化磁珠试剂盒批量提取常规生物检材要求十分迫切,比如作为DNA数据库的常规样本,群死群伤案件发现的血痕、侯时性案件等。烟蒂等脱落细胞检材数量较多,开始采用大型的自动化工作平台进行批量操作的尝试,并在很多重大且脱落细胞检材繁多的案件中可以又好又快的提供线索和证据,但在基层、一线单位,脱落细胞类生物检材的DNA提取,大部分DNA实验室为了保证提取DNA效果仍然以手工提取为主、或者手工提取结合一些半自动化的纯化仪,比如Maxwell 16核酸纯化仪等。因此使用一些自动化工作站结合一些商品化试剂盒进行批量提取成为一个可行的尝试。本课题利用核酸提取工作站epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒通过对常见的脱落细胞检材-烟蒂的各种状态进行系统的研究,初步建立一个适合烟蒂的提取的流程,同时对手工chelex-100提取、核酸提取工作站epMotion 5075结合DNA IQTM、MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒等提取方法以及核酸提取工作站epMotion 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒DNA提取DNA产物使用各种PCR扩增体系扩增效果进行了比较研究,初步建立烟蒂脱落细胞检材批量检验方法,运用到实际案件中的烟蒂的批量检验。同时尝试将核酸提取工作站epMotion 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒批量提取烟蒂的方法运用到微量脱落细胞的检验中,建立一个适合基层批量提取脱落细胞DNA的技术流程,提高脱落细胞STR检验的检验时效。一、批量烟蒂提取的方法学的比较利用志愿者提供的“双喜”牌烟蒂30枚,结合手工chelex-100提取、核酸提取工作站epMotion 5075结合DNA IQTM、MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒的检验结果进行比较,明确建立核酸提取工作站epMotion 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒批量提取烟蒂脱落细胞的可行性,初步建立一个适合烟蒂脱落细胞提取的流程。实验结果显示：利用核酸提取工作站epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNAMini M48 Kit试剂盒批量提取烟纸的过程中,不同的裂解体系,只要保证烟纸能够完全浸泡在裂解液里,均可以得到完整的DNA分型；裂解30分钟以上均得到了完整的DNA分型。在裂解过程中,是否封膜对裂解的效果不存在明显的影响,在裂解过程中不封膜也没有发生检材间的相互污染。结果显示,3种提取方法中,chelex-100法提取的DNA含量平均值为0.8307ng/μl,在三种方法中最高,IQTM系统提取的DNA含量平均值为0.4875 ng/μl,含量最低。M48体系的DNA含量平均值为0.4990ng/μl,在两者之间。但检测的效果,M48体系的检测效果最好,检出12个位点以上的有29例,IQTM系统其次,27例,chelex-100法最低,只有26例。结果显示,M48 Kit系统结合核酸提取工作站epMotion（?）5075提取烟蒂脱落细胞优于手工chelex-100提取及核酸提取工作站epMotion 5075结合DNA IQTM。二、不同品牌烟蒂STR分型效果比较利用收集志愿者提供的广东生产的六个品牌的烟蒂600枚进行批量提取、并从中随机抽取40枚收集志愿者提供的烟蒂分别放置1周、7周、10周后进行批量提取,将不同烟蒂的效果比较,并根据检验效果对提取的程序进行优化,进一步完善批量提取烟蒂脱落细胞的工作站提取体系。中高档的烟蒂的烟纸因为做过防渗透处理,渗透性较差,在转移速度为150ul/s及100ul/s的时候,有92例及80例STR基因座检出数在12个以下,而在转移速度为50ul/s的时候,均检出了12个以上的STR的位点。而渗透性较好的低档烟蒂的烟纸,以上三种转移速度均检出了12个以上的STR的位点。因此,对于渗透性较差的载体,可以适度的降低转移裂解液的速度,以避免或减少堵塞枪头的机会。低档和中档烟蒂及高档双喜逸品的烟蒂均检出12个以上的STR位点的基因型,而高档五叶神的烟蒂烟纸有8例检出的位点为9-12个STR位点之间,原因为,五叶神的烟蒂烟纸有大量的色素溢出。随机抽取30例以上六个品牌的15个基因座中平均片段大小区间在101.68-190.83的D19S433、D3S1358、D8S1179、 D6S1043和平均片段大小区间在255.26-359.29的D7S820、D18S51、CSF1PO、 D2S1338的峰高的平均值进行统计,五叶神烟蒂的大、小片段的峰高比值相对较其他五个品牌为低,说明存在一定的扩增抑制。随机抽取30例五叶神烟蒂一次、二次洗涤的结果进行比较,二次洗涤后虽然大、小片段平均峰值的比值增加了,但检出的STR位点的平均峰值确有所降低。在增加洗涤次数的情况下,可以进一步的去除抑制物的浓度,但对DNA的提取浓度有一定的影响,因此需要综合考虑,结合样本的条件设计合适的提取程序,进行批量提取。为了进一步减少载体对批量提取的影响,根据不同的生物检材的特点对批量提取的程序进行微调,不失是一个解决问题的方法。三、三种扩增体系STR分型效果比较利用收集志愿者提供的100枚烟蒂利用核酸提取工作站epMotion（?）5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒批量提取的DNA产物利用使用sino-filer、 PowerPlex.21、AGCU EX22 STR扩增系统进行分型一致性的研究。结果显示,以上100例利用核酸提取工作站epMotion（?）5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit提取试剂盒批量提取的烟蒂,使用sino-filer、PowerPlex.21、 AGCU EX22 STR扩增系统检出的相同的15个str位点的基因座分型完全一致、无发生位点漏扩或缺失。使用三个不同的扩增体系相同生物检材的相同str位点的峰高、峰面积基本一致。杂合子两峰的峰高均未出现PHR<0.5的基因座,峰值均衡,短片段、长片段不存在明显不均衡扩增。因此核酸提取工作站epMotion（?）5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit提取试剂盒可以较好地解决由于使用者的个人原因和检材的质地、检材的提取送检方式的不同导致不同类型甚至同一类型的不同检材提取的DNA量非常悬殊的STR分型难题,特别适于自动化提取生物检材的DNA提取。综上所述,核酸提取工作站epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit提取试剂盒是批量提取烟蒂检验较理想的方法。四、拓展应用对广州市公安局番禺区分局日常检案微量体表脱落细胞200例使用核酸提取工作站epMotion（?）5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit提取试剂盒的检验效果与2008年以来广州市公安局番禺区分局日常检案微量体表脱落细胞chelex-100法提取的结果、2010年以来广州市公安局番禺区分局日常检案微量体表脱落细胞Maxwell 16核酸纯化仪提取的结果进行比较,使用epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒批量提取微量脱落细胞的总的成功率与手工提取结合Maxwell 16核酸纯化仪纯化的成功率相似,但在检验效率及规范化等方面均优于手工提取结合Maxwell 16核酸纯化仪纯化的方法。同时使用epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒批量提取微量脱落细胞的成功率高于手工chelex-100法提取。使用epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit试剂盒批量提取烟蒂的方法同样适用微量检材的提取,可以在公安机关的基层DNA实验室推广,对提高基层DNA实验室微量检材的检验效率,促进公安机关的基层DNA实验室的自动化、规范化检验具有一定的价值。结合实际案例,进一步证明使用核酸提取工作站epMotion（?） 5075结合MagAttract（?） DNA Mini M48 Kit提取试剂盒在实际工作中具有可行性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 批量烟蒂提取的方法学的比较
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 不同品牌烟蒂STR分型效果比较
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 结论
• 第三章 三种扩增体系STR分型效果比较
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 结论
• 第四章 拓展应用效果
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 结论
• 4.5 案例应用
• 参考文献
• 在读硕士期间发表的论文
• 中英文缩略词表
• 致谢