玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

论文摘要

目前植物基因工程广泛应用的启动子是CaMV35S组成型启动子,它驱动外源基因在植物的各种组织和所有发育阶段都会表达,不但造成物质和能量上的巨大浪费,还会引起植物的形态发生变化,影响植物的生长发育。利用组织特异性启动子指导外源基因定向地在人们预定的时间和空间、组织或器官表达,是实现对目标基因高效表达的重要途径,也是培育高效、安全转基因作物的首选。植物的生长发育受基因调控,根部特异性启动子是调控基因表达的关键元件之一。植酸是一种抗营养因子,同时也是植物体内磷的主要存在形式,其大部分不能被单胃动物消化吸收,而随粪便排出体外造成环境磷污染。通过植酸酶的作用,植酸盐可以水解成无机磷和肌醇,其水解过程能释放出肌醇和一些微量元素,从而可以提高植物性食品和饲料的营养价值,因此它具有分解植酸盐的特殊作用。植酸酶分解存在于谷物中的磷酸主要贮藏物质植酸,使磷酸游离出来,进而促进鸡和猪等难吸收植酸的单胃动物吸收磷酸。利用根部特异性启动子在粮食作物中提高植酸酶的表达量,创造低植酸的转基因作物,对于提高食品营养价值,促进人类健康具有重大的现实意义。本研究主要克隆玉米根部特异性表达启动子ZmGLU1P,并对其功能进行鉴定,在此基础上构建玉米根部特异性启动子驱动植酸酶基因的重组植物表达载体,通过花粉管通道法和农杆菌介导法将其导入玉米中,以期在根部中特异性表达,为外源植酸酶基因在玉米根部中高效表达提供了有用的调控元件。根据已发表的玉米β-葡萄糖苷酶基因启动子（GenBankDQ333310）序列,设计一对引物,利用PCR技术从玉米品种P138基因组DNA中分离得到玉米根部特异性启动子DNA片段ZmGLU1P,并将其克隆到pMD18-T Vector上。测序结果表明所克隆的片段长为1846bp,与预期结果相符。该片段与己发表的玉米β-葡萄糖苷酶基因启动子序列的同源性为99%,并含典型的TATA盒和CAAT盒,以及根部特异表达所必须的调控元件。用ZmGLU1P基因替代植物表达载体PBI121的CaMV35S启动子,与GUS基因连接,获得了由该启动子启动GUS报告基因的重组植物表达载体ZmGLU1P-GUS。通过液氮冻融法将重组质粒ZmGLU1P-GUS转化到农杆菌EHA105中,采用叶盘法转化烟草品种NC89。在含有Kan的MS选择培养基上进行筛选培养,结果获得了转ZmGLU1P-GUS的烟草植株,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测,结果显示成功地获得了转基因烟草植株。为了验证所扩增的启动子是否具有根部特异性表达的功能,我们对转基因烟草的根、茎、叶分别进行GUS组织化学分析。结果表明,转基因烟草的茎和叶未显色,而根部显蓝色,表现出明显的根部特异性,由此表明ZmGLU1P启动的GUS基因在根中能特异性表达。为了使外源基因在根部特异性启动子的调控下高效表达,进而对玉米品质进行改良,我们构建了植物表达载体PCAMBIA3301-ZmGLU1P-PhyA-NOS。它是将终止子和玉米根部特异性启动子以及植酸酶PhyA基因依次插入到植物表达载体PCAMBIA3301上使ZmGLU1P高效启动下游PhyA基因的表达。通过花粉管通道法及农杆菌介导法转化到玉米中并获得了批量转化植株,对T0代转化植株进行了PCR和Southern杂交检测,得到2棵转基因玉米植株。ii

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 启动子的性质、分类及研究进展
• 1.2 植酸酶及其基因工程研究进展
• 1.3 玉米遗传转化方法
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 玉米根部特异启动子的克隆及功能研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 第三章 PhyA基因根部特异性表达载体的构建及转化
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 图版说明