单环刺螠多肽的分离纯化及生物活性研究

论文摘要

海洋生物处于高压、高盐、低温、寡营养等环境特点,为了适应这些极端的海洋生境,生物自身的功能分子组成或结构都与陆地功能分子有很大的不同。目前从海洋生物中分离出的多肽类化合物大多具有抗肿瘤、抗病毒及增强免疫力等生物活性,从海洋生物中分离多肽类化合物进行生物活性研究已经引起科研人员的广泛关注。本实验根据以上研究背景,选取单环刺螠体腔液进行多肽的分离纯化,并对分离出的多肽进行性质研究。利用分级超滤技术收集单环刺螠体腔液中分子量小于8000D的物质组分,经凝胶过滤层析及离子交换层析分离出多肽纯品,通过SDS-PAGE电泳测定多肽的分子量在6000D左右,多肽的收率为31.7%。通过体外实验的方法研究单环刺螠多肽对各种肿瘤细胞的生长的影响及对正常肝细胞生长的影响。以人肝癌细胞、Hela细胞及S180肉瘤细胞为研究对象,通过MTT法测定该多肽对这三种肿瘤细胞生长的影响。结果表明,单环刺螠多肽对以上三种肿瘤细胞均有一定抑制生长的作用,但对肝癌细胞生长的抑制作用比较明显,当多肽浓度为500μg/ml时,抑制率接近80%,其他两种分别为37.5%、19.8%。在抑制肿瘤细胞生长的浓度范围内检测该多肽对正常肝细胞生长的影响,证明该多肽对正常肝细胞没有明显的毒副作用。通过体内灌胃方法研究单环刺螠多肽对小鼠S180肉瘤模型肿瘤生长的影响。结果表明该多肽对肿瘤有一定的抑制作用,当多肽剂量为750mg/kg bw时,抑制率可达31.9%,与对照组相比,存在显着性差异（P<0.05）,但是效果仍没有阳性对照组（环磷酰胺组）明显。通过体内实验方法研究该多肽对免疫功能的影响。以昆明种小鼠为研究对象,将实验动物进行分组,实验组每天分别灌服不同剂量的多肽溶液（250、500、750mg/kg bw）,连续20天,对各项免疫指标进行测定,主要包括对单核巨噬细胞吞噬功能（碳粒廓清法）、腹腔巨噬细胞增殖能力、吞噬中性红能力、分泌细胞因子功能（IL-1）的影响,以及对小鼠免疫器官指数（脾脏指数和胸腺指数）的影响。实验结果表明,单环刺螠多肽在体内促进免疫功能效果显著。给小鼠灌服不同剂量的多肽,均可提高小鼠体内单核巨噬细胞的碳廓清指数,有增强腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力和分泌细胞因子功能的作用,并且能够提高小鼠的脾脏和胸腺指数。随着多肽剂量的增加,各项指标均有一定的提高, 750mg/kg bw给药剂量组与对照组比较,各项免疫指标均有显著性差异（P<0.05）。从上述各项指标表明该多肽能够提高小鼠的非特异性免疫功能,并促进细胞免疫功能。本实验结果表明,单环刺螠多肽对肿瘤细胞有一定的抑制作用,对细胞免疫和非特异性免疫功能均有明显的促进作用,能够显著增强小鼠的免疫功能,为进一步研究其生理功能提供理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 前言
• 1 海洋抗肿瘤药物的研究进展
• 1.1 海生素
• 1.2 膜海鞘素
• 1.3 ET-743
• 1.4 刺参酸性粘多糖
• 1.5 海星皂苷
• 1.6 海兔毒素
• 1.7 海力特
• 1.8 羊栖菜多糖
• 1.9 阿糖胞苷
• 1.10 血管形成抑制因子
• 1.11 苔藓虫素
• 2 海洋抗肿瘤多肽的研究进展
• 2.1 海洋天然活性肽
• 2.1.1 海绵多肽
• 2.1.2 海葵多肽
• 2.1.3 海鞘多肽
• 2.1.4 海兔多肽
• 2.1.5 芋螺多肽
• 2.1.6 海星多肽
• 2.1.7 海藻多肽
• 2.1.8 鱼类多肽
• 2.1.9 贝类多肽
• 2.1.10 生物防御素
• 2.2 海洋酶解生物活性肽
• 2.3 海洋活性肽的吸收情况
• 2.4 前景与展望
• 3 其它途径获得的抗肿瘤多肽
• 3.1 从其它生物中提取的天然多肽
• 3.2 化学合成肽库
• 3.3 噬菌体展示技术肽库
• 4 单环刺螠的相关研究
• 4.1 单环刺螠分类
• 4.2 形态解剖
• 4.3 营养成分分析及活性物质
• 4.4 硫化物耐受机制
• 4.5 未来展望
• 5 立论依据与意义
• 第二章 单环刺螠多肽的制备及分离纯化
• 2.1 概述
• 2.2 材料、试剂与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 多肽粗品的制备
• 2.3.2 多肽的分离纯化
• 2.3.3 蛋白浓度测定
• 2.3.4 多肽的性质分析
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 单环刺螠多肽的分离纯化结果
• 2.4.2 多肽的蛋白含量测定
• 2.4.3 多肽的纯度及分子量测定
• 2.5 讨论
• 第三章 单环刺螠多肽抗肿瘤作用的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料、试剂与仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 溶液的配制
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 多肽对肝癌细胞（SMMC-7721）生长的影响
• 3.3.2 多肽对Hela 细胞生长的影响
• 180肉瘤细胞生长的影响'>3.3.3 多肽对S₁₈₀肉瘤细胞生长的影响
• 3.3.4 多肽对正常肝细胞（HL-7702）生长影响的实验
• 180肉瘤的实验'>3.3.5 多肽抑制小鼠S₁₈₀肉瘤的实验
• 3.3.6 统计学处理
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 单环刺螠多肽对肝癌细胞（SMMC-7721）生长的影响
• 3.4.2 单环刺螠多肽对Hela 细胞生长的影响
• 180肉瘤细胞生长的影响'>3.4.3 单环刺螠多肽对S₁₈₀肉瘤细胞生长的影响
• 3.4.4 单环刺螠多肽对正常肝细胞（HL-7702）生长影响的实验结果
• 180肉瘤的实验结果'>3.4.5 单环刺螠多肽抑制小鼠S₁₈₀肉瘤的实验结果
• 180肉瘤小鼠肿瘤组织病理学观察结果'>3.4.6 S₁₈₀肉瘤小鼠肿瘤组织病理学观察结果
• 3.5 讨论
• 第四章 单环刺螠多肽增强免疫功能的实验研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料、试剂与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 溶液的配制
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 单环刺螠多肽对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
• 4.3.2 单环刺螠多肽对小鼠 PMФ 产生 IL-1 能力的测定
• 4.3.3 单环刺螠多肽对小鼠 PMФ 吞噬中性红能力的影响
• 4.3.4 单环刺螠多肽对脾淋巴细胞增殖能力的影响
• 4.3.5 单环刺螠多肽对免疫器官的影响
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 单环刺螠多肽对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响结果
• 4.4.2 单环刺螠多肽对小鼠 PMФ 产生 IL-1 能力的试验结果
• 4.4.3 单环刺螠多肽对小鼠 PMФ 吞噬中性红能力的结果
• 4.4.4 单环刺螠多肽对脾淋巴细胞增殖能力的影响结果
• 4.4.5 单环刺螠多肽对小鼠免疫器官的影响结果
• 4.5 讨论
• 第五章 总 结
• 参考文献
• 致谢