阳离子抗菌肽G13分泌表达系统的构建

论文摘要

为进一步深入研究阳离子抗菌肽G13的结构功能关系,摸索高效表达的方式,我们构建了原核分泌表达系统。质粒pET-22b（+）能将外源蛋白分泌到大肠杆菌细胞周质中,有利于分离纯化目的蛋白。在G13的基础之上用平末端连接的方式拼接相关融合蛋白基因,成功构建重组质粒pET-22b（+）-DPG13、pET-22b（+）-D3PG13、pET-22b（+）-C-DPG13、pET-22b（+）-C-D6PG13DP,利用信号肽的引导作用进行G13的分泌表达。结果只有pET-22b（+）-C-DPG13得到目的蛋白,虽然产量达不到要求,但证明了原核分泌表达系统表达G13的可行性,G13序列的改造、诱导表达条件的优化等需要进一步实验来完成。为评估G13作为饲料添加剂的可行性,本实验构建了真核分泌表达系统。PCR搭桥获取以酵母密码子偏好性设计的G13序列,TA克隆测序。双酶切后连接整合型载体pPIC9,成功构建pPIC9-G13。线性化重组质粒,经过乙醇沉淀处理电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选His+Muts转化子,相应培养基诱导表达。抑菌实验未检测到生物活性,蛋白电泳也没有检测到目的蛋白。后续试验应着手验证mRNA是否转录翻译,明确G13无法表达的原因。同时本实验用PCR搭桥得到来源于鱼类的抗菌肽Pleurocidin以及人防御素hBD-3的基因,成功构建了重组质粒pPIC9-Ple、pPIC9-HBD-3,这两种抗菌肽在食品和医疗方面具有潜在的应用价值,转化子的保存为后续的表达研究打下了基础。本实验还从巢湖分离得到一株微囊藻,命名为chaohu-1,序列已提交GenBank。我们利用分子生物学方法鉴定了其种属是铜绿微囊藻；通过HPLC检测了产毒特性,证实了此藻株产生MC-LR藻毒素；此外还建立了该藻株可行的冻存复苏体系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1. 阳离子抗菌肽
• 1.1 研究进展
• 1.2 颗粒裂解肽G13结构域
• 2. 分泌表达系统
• 2.1 大肠杆菌分泌表达系统
• 2.2 毕赤酵母分泌表达系统
• 3. 本研究的目的和意义
• 第二章 原核分泌表达体系的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 相关化学试剂及试剂盒
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 G13基因片段及相关引物的设计合成
• 2.2.2 G13与融合蛋白的拼接设计及目的片段的获取
• 2.2.3 目的片段的回收
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 DNA片段的连接和转化
• 2.2.6 重组子的筛选
• 2.2.7 诱导表达
• 2.2.8 蛋白电泳检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 重组子的鉴定
• 2.3.2 G13在大肠杆菌中的表达
• 2.4 讨论
• 第三章 真核分泌表达体系的构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 相关培养基
• 3.1.3 工具酶
• 3.1.4 相关化学试剂及试剂盒
• 3.1.5 主要实验仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 G13基因片段及引物的设计合成
• 3.2.2 目的片段的获取
• 3.2.3 TA克隆、转化、鉴定
• 3.2.4 穿梭质粒在大肠杆菌中的筛选
• 3.2.5 酵母感受态细胞的制备
• 3.2.6 待整合基因片段的制备及电击转化
• 3.2.7 酵母重组子的筛选
• 3.2.8 诱导表达及活性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组质粒的鉴定
• 3.3.2 酵母重组子的筛选
• 3.3.3 G13在毕赤酵母中的表达
• 3.4 讨论
• 第四章 其余阳离子抗菌肽重组质粒的构建
• 4.1 Pleurocidin和hBD-3
• 4.2 pPIC9-Ple、pPIC9-HBD-3的构建
• 4.3 重组质粒的验证
• 第五章 来自巢湖产毒微囊藻株的分离、纯化、保存
• 5.1 材料
• 5.1.1 藻类的采集及处理
• 5.1.2 质粒及菌株
• 5.1.3 相关培养基
• 5.1.4 工具酶及相关试剂
• 5.1.5 主要实验仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 藻样的预备养
• 5.2.2 藻株的分离、纯化
• 5.2.3 产毒基因序列的PCR扩增及鉴定
• 5.2.4 藻毒素的粗制备及鉴定
• 5.2.5 冻存及复苏方式的交叉实验
• 5.3 结果
• 5.3.1 铜绿微囊藻藻株的获取
• 5.3.2 产毒区基因序列比对分析
• 5.3.3 藻毒素的HPLC分析
• 5.3.4 藻株最适保存方式的分析
• 5.4 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录