氯霉素兔单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

论文摘要

氯霉素（Chloramphenicol, CAP）是一种广谱抗生素,对革兰氏阳性菌、阴性菌均有良好的抑制作用。因而广泛应用于畜牧、水产养殖业。但在动物性食品内残留的CAP对人体的健康具有潜在的危害。为此,世界上许多国家均制定了氯霉素的最高残留标准,严格限制其使用。为了适应加入WTO后的国际竞争与挑战,必须建立起一种具有自主知识产权的快速检测方法。酶联免疫吸附检测法（ELISA）作为一种快速、高效的免疫检测技术正逐步应用于CAP的检测。本研究用重氮化法合成了氯霉素的人工抗原,通过免疫兔子获得脾脏,继而利用杂交瘤技术、重组抗体技术获得高亲和性、高特异性的抗氯霉素的单克隆抗体,优化了间接竞争ELISA法的检测条件,初步建立了牛奶、蜂蜜等样品中氯霉素残留的ELISA检测技术。主要研究结果如下：1氯霉素人工抗原的合成及鉴定用重氮化法合成了氯霉素免疫抗原（CAP-BSA）以及包被抗原（CAP-OVA）.用紫外扫描、SDS-PAGE电泳、飞行时间质谱对免疫抗原进行鉴定,证实人工抗原合成成功。用飞行时间质谱测定免疫抗原中BSA与CAP的偶联率为1：22。利用BCA蛋白试剂盒测得免疫抗原蛋白浓度为3.8mg/mL,包被抗原蛋白浓度为2.0mg/mL。2免疫及兔抗血清筛选用CAP-BSA免疫4只新西兰大白兔,编号76,77,78,79。以HRP为二抗,TMB为显色体系,对四只兔子的抗血清进行ELISA检测。其中76号兔子抗血清效价达128000,IC50达0.16μg/mL,选择76号兔子脾脏进入下一步融合。3兔单克隆抗体的制备及纯化采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强,细胞生长状态良好的杂交瘤细胞9-3。小转后获得了6株CAP单抗质粒。通过间接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定CAP 9-3H1/L2质粒进入大转生产。采用Protein A纯化方法纯化并收集CAP单克隆抗体,共得10mLCAP单克隆抗体,IgG浓度为1.23mg/mL。4 ELISA检测条件优化通过间接ELISA试验以及间接竞争ELISA试验,对CAP单抗ELISA检测条件进行了优化,最终确定CAP单抗ELISA检测条件如下：包被原10000倍稀释,50 uL每孔,4℃包被12h；含0.05%Tween-20的TBST洗涤四次；3%脱脂乳封闭1 h；用pH 8.0,离子浓度为0.1mol/L的TBS缓冲液稀释小分子竞争物和一抗。一抗稀释16000倍,与系列浓度的小分子竞争物各50uL,37℃孵育1h；12000倍二抗,50uL/每孔,37℃反应45min；显色底物配方：A液B液等体积混合。50uL/每孔,显色15 min；2mol/L硫酸,50 uL/每孔终止,OD450读数。5抗体免疫学性质研究该兔单克隆抗体对氯霉素有很强的亲和性。当氯霉素浓度达到0.1ng/mL即可产生10%抑制率。而当浓度在1.06ng/mL时可产生50%的抑制率。氯霉素间接竞争ELISA标准曲线方程：标准曲线y=38.447x+49.082,R2=0.9924,线性良好。检测范围在0.18-6.37ng/mL之间,最低检测限是0.1ng/mL。同时该抗体对氯霉素具有较高的特异性,除了和琥珀氯霉素酸钠,甲砜霉素,氟甲砜霉素交叉反应率分别为2.09%,18.10%,12.45%外,和其他的喹诺酮类以及磺胺类药物均无交叉反应。6样品回收率检测该氯霉素单克隆抗体在猪尿样品检测中,回收率在73.31%-109.62%之间,变异系数介于6.98%-17.94%之间。在新鲜牛奶样品检测中,回收率在71.03%-95.01%之间,变异系数介于8.16%-16.93%之间。在蜂蜜检测中,回收率在71.10%-87.96%之间,变异系数介7.52%-14.74%之间。上述试验表明,本实验建立的间接竞争ELISA法可满足检测需要,有潜在的应用前景。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 动物性食品兽药残留现状
• 1.2 兽药残留危害
• 1.2.1 毒性作用
• 1.2.2 过敏反应
• 1.2.3 诱导细菌耐药性
• 1.2.4 对环境的影响
• 1.3 氯霉素概况及危害
• 1.3.1 理化性状
• 1.3.2 抗菌作用
• 1.3.3 代谢及残留危害
• 1.4 氯霉素残留检测方法
• 1.4.1 微生物法
• 1.4.1.1 棉签法
• 1.4.1.2 杯碟法
• 1.4.2 色谱法
• 1.4.2.1 高效液相色谱法
• 1.4.2.2 气相色谱法
• 1.4.2.3 联用技术
• 1.4.3 免疫分析
• 1.4.4 三类检测方法的优缺点比较
• 1.5 小分子人工抗原合成进展
• 1.5.1 人工抗原改造
• 1.5.2 影响人工抗原质量的因素
• 1.6 选题意义及拟采用的技术路线图
• 1.6.1 选题意义
• 1.6.2 技术路线图
• 第二章 氯霉素多克隆抗体的制备
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 溶液系统
• 2.1.5 其他材料
• 2.1.6 氯霉素人工抗原的制备与鉴定
• 2.1.6.1 氯霉素免疫抗原与包被抗原的制备
• 2.1.6.2 紫外波长扫描
• 2.1.6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.1.6.4 飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）测定偶联率
• 2.1.6.5 人工抗原蛋白浓度测定
• 2.1.7 兔多抗血清的制备
• 2.1.8 兔多抗血清筛选
• 2.1.8.1 兔多抗血清效价测定
• 2.1.8.2 抗血清亲和性测定
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 人工抗原的鉴定
• 2.2.1.1 紫外扫描法
• 2.2.1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.1.3 MALDI-TOFMS图谱
• 2.2.1.4 人工抗原蛋白浓度测定
• 2.2.2 多抗血清检测
• 2.2.2.1 血清效价检测
• 2.2.2.2 血清亲和性试验
• 2.3 讨论
• 第三章 氯霉素兔单克隆抗体的制备及ELISA方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要设备
• 3.1.3 细胞
• 3.1.4 细胞融合
• 3.1.5 交瘤细胞筛选
• 3.1.6 重组抗体技术生产氯霉素单克隆抗体
• 3.1.7 ELISA检测方法的建立与优化
• 3.1.7.1 包被抗原最佳浓度
• 3.1.7.2 一抗最佳浓度
• 3.1.7.3 包被条件的优化
• 3.1.7.4 封闭液的确定
• 3.1.7.5 洗液中Tween-20含量的确定
• 3.1.7.6 TBS缓冲液钠离子浓度
• 3.1.7.7 缓冲液pH
• 3.1.7.8 竞争时间的优化
• 3.1.7.9 HRP-IgG反应时间
• 3.1.7.10 显色时间
• 3.1.7.11 TMB存储液与底物缓冲液比例
• 3.1.7.12 优化后的间接竞争ELISA检测方法
• 3.1.8 CAP单克隆抗体免疫学性质鉴定
• 3.1.8.1 单抗亲和性试验
• 3.1.8.2 单抗特异性试验
• 3.1.8.3 氯霉素标准曲线的建立
• 3.1.9 CAP回收率的测定
• 3.1.9.1 猪尿样品处理及标准曲线的建立
• 3.1.9.2 牛奶样品处理及标准曲线的建立
• 3.1.9.3 蜂蜜样品处理及标准曲线的建立
• 3.1.9.4 ELISA准确度测定
• 3.1.9.5 ELISA精密度测定
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 杂交瘤细胞的筛选与克隆
• 3.2.2 重组抗体技术生产氯霉素单克隆抗体
• 3.2.2.1 小转检测结果
• 3.2.2.2 大转检测结果
• 3.2.3 ELISA条件优化
• 3.2.3.1 最佳包被抗原浓度
• 3.2.3.2 一抗浓度的确定
• 3.2.3.3 最佳包被条件的确定
• 3.2.3.4 封闭液种类和浓度
• 3.2.3.5 Tween-20含量
• 3.2.3.6 Na离子浓度的筛选
• 3.2.3.7 缓冲液体pH的选择
• 3.2.3.8 竞争时间的确定
• 3.2.3.9 HRP-IgG反应时间的确定
• 3.2.3.10 显色时间的确定
• 3.2.3.11 TMB存储液与底物缓冲液比例
• 3.2.3.12 优化以后的间接竞争ELISA检测条件
• 3.2.4 单克隆抗体免疫学性质鉴定
• 3.2.4.1 单抗对氯霉素的亲和能力测定
• 3.2.4.2 特异性试验
• 3.2.4.3 氯霉素单克隆抗体间接竞争标准曲线的建立
• 3.2.5 CAP回收率试验
• 3.2.5.1 猪尿样品检测结果
• 3.2.5.2 新鲜牛奶样品检测结果
• 3.2.5.3 蜂蜜样品检测结果
• 3.3 讨论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 人工抗原的合成及鉴定
• 4.2 多抗血清检测及脾细胞筛选
• 4.3 氯霉素兔单克隆抗体的制备
• 4.4 ELISA检测条件优化及标准曲线制作
• 4.5 CAP回收率试验
• 4.6 创新性
• 4.7 研究展望
• 参考文献
• 作者简历