SCOTS技术的建立及在副猪嗜血杆菌功能基因筛选中的应用

论文摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌,在特定条件下侵入机体可以引起严重的全身性疾病(Gl(?)sser氏病),以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征。该病给世界养猪业带来严重经济损失,2007年对中国养猪业造成损失巨大的猪高热病,猪副嗜血杆菌病也是重要的并发症之一。HPS血清型很多,到目前为止,己确定有15个血清型和有20%以上的分离株不能分型(Kielstein et al.,1992),其中在中国血清型4、5、13最为常见(Cai,2005)。该病原菌的主要毒力因子包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、神经氨酸酶等,随着新的研究手段的出现,一些新的致病因子逐渐被发现。本研究包括如下两个方面的内容:1.SCOTS技术的建立转录序列选择性捕获(selective capture of transcribed sequences,SCOTS)已经成功地用于捕获多种病原菌在动物感染组织和体外应激条件下上调表达的转录序列。本研究着力于建立该技术方法来筛选副猪嗜血杆菌的功能性基因,以便发现副猪嗜血杆菌新的毒力因子。用5×10~8CFU副猪嗜血杆菌5型0165菌株感染30日龄的健康仔猪,感染7日后解剖取肺组织,分别提取感染了HPS的猪肺组织和培养于TSB的HPS的总RNA,并通过反转录使体内外的cDNA分别带上不同的体内外标签。其中HPS感染肺组织cDNA一共经过六轮SCOTS,获得HPS在感染猪肺组织中表达上调的cDNA。利用反向斑点杂交技术(Reverse dot blot,RDB)来确定试验的最佳条件。结果表明:杂交液中探针的终浓度为50ng/ml时效果最好;尼龙膜在紫外交联仪中照射短波紫外光0.15 J/cm~2为最佳剂量;PCR扩增的片段作为目标DNA,敏感度高;选取PCR扩增的片段的上样量为1μg最佳。将对应SCOTS库中阳性克隆的PCR扩增片段分别与HPS基因组探针、经过了三轮SCOTS的体内、外cDNA文库探针进行杂交,筛选出HPS在体外培养条件下表达量较低的cDNA。最后我们通过对表达基因的片段测序并在GenBank进行BLAST分析比较,发现结果与预想符合,为副猪嗜血杆菌或是亲缘较近的细菌的基因片段。2.用SCOTS技术筛选副猪嗜血杆菌的热应激基因本研究通过己建立的SCOTS技术与反向斑点杂交(Reverse dot blot,RDB)技术相结合筛选副猪嗜血杆菌的功能基因,结果表明:在筛选到的差异表达的功能基因中,通过序列相似性的比较,鉴定了副猪嗜血杆菌的40个高温应激基因。目前,仅发现了数量有限的副猪嗜血杆菌的致病因子,随着新的研究方法的出现,新的毒力因子将被逐渐发现和认识。本文通过将SCOTS技术和RDB技术相结合,筛选到副猪嗜血杆菌的高温应激基因,可以围绕这些基因开展深入的研究,为副猪嗜血杆菌病的防治提供新的依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第1章 文献综述
• 1.1 副猪嗜血杆菌的研究现状
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 危害与防制
• 1.1.3 致病机理研究进展
• 1.1.4 毒力因子研究进展
• 1.1.4.1 脂多糖（LPS）
• 1.1.4.2 外膜蛋白（OMP）
• 1.1.4.3 转铁结合蛋白（TBP）
• 1.1.4.4 神经氨酸酶（NA）
• 1.1.4.5 荚膜多糖（CPS）
• 1.2 SCOTS技术概述
• 1.2.1 多种差异显示技术比较
• 1.2.1.1 差异显示 PCR（DD-PCR）
• 1.2.1.2 抑制消减杂交法（SSH）
• 1.2.1.3 DNA芯片技术（DNA chip technique）
• 1.2.1.4 基因表达系统分析（SAGE）
• 1.2.1.5 体内表达技术（IVET）
• 1.2.1.6 信号标签突变技术（STM）
• 1.2.1.7 代表性差异分析（RDA）
• 1.2.2 SCOTS技术原理与应用
• 1.3 反向斑点杂交技术
• 1.3.1 反向斑点杂交技术的原理
• 1.3.2 反向斑点杂交技术的应用
• 第2章 SCOTS技术的建立
• 2.1 目的及意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株质粒、培养条件及PCR引物
• 2.2.2 主要药品、试剂和仪器
• 2.2.3 实验动物
• 2.2.4 分子生物学软件
• 2.2.5 细菌计数
• 2.2.6 实验动物的分组与感染
• 2.2.7 菌株的分离与鉴定
• 2.2.8 感染组织总RNA的提取及细菌RNA的提取
• 2.2.9 cDNA的合成和扩增
• 2.2.10 转录序列的选择性捕获（SCOTS）
• 2.2.10.1 细菌基因组的提取及其生物素标记
• 2.2.10.2 细菌rDNA的合成
• 2.2.10.3 cDNA样品的预杂交及杂交
• 2.2.10.4 转录序列的捕获
• 2.2.10.5 SCOTS文库的克隆
• 2.2.11 反向斑点杂交方法的建立
• 2.2.11.1 反向斑点杂交的操作方法
• 2.2.11.2 靶DNA浓度、探针浓度、紫外照射剂量的优化
• 2.2.11.3 PCR片段与基因组、体内和体外cDNA文库分别进行斑点杂交
• 2.2.11.4 测序评价反向点杂交法对cDNA文库筛选的可行性
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 细菌计数
• 2.3.2 实验动物的感染
• 2.3.3 菌株的分离与鉴定
• 2.3.4 感染组织RNA的提取
• 2.3.5 SCOTS库的建立
• 2.3.6 靶DNA浓度、探针浓度、紫外照射剂量的优化
• 2.3.7 PCR片段与基因组、消减了核糖体 DNA的体内和体外cDNA文库分别进行斑点杂交
• 2.3.8 测序评价反向点杂交法对cDNA文库筛选的可行性
• 2.4 结论及讨论
• 第3章 用SCOTS技术筛选副猪嗜血杆菌高温应激基因
• 3.1 目的与意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株、质粒、培养条件及 PCR引物
• 3.2.2 主要药品、试剂和仪器
• 3.2.3 分子生物学软件
• 3.2.4 细菌 RNA的提取
• 3.2.5 cDNA的合成和扩增
• 3.2.6 细菌基因组的提取及其生物素标记
• 3.2.7 cDNA样品的预杂交及杂交
• 3.2.8 转录序列的捕获
• 3.2.9 SCOTS文库的克隆
• 3.2.10 反向斑点杂交筛选高温应激基因
• 3.2.11 DNA测序与功能注释
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 应用SCOTS技术获得的副猪嗜血杆菌高温应激功能基因
• 3.3.2 获得的副猪嗜血杆菌高温应激基因与毒力因子之间的关系
• 3.3.3 获得的副猪嗜血杆菌高温应激基因的应用前景
• 3.4 结论及讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录