雷公藤甲素脂质体的制备及质量的初步研究

论文摘要

雷公藤甲素（又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇;或Triptolide, TP）,是中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. F.）中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物,雷公藤甲素（TP）在治疗各种免疫性疾病、炎性疾病及癌症方面起了很大作用。但其临床不良反应的发生频率高,主要发生在消化系统、泌尿系统、生殖系统、心血管系统、骨髓和血液系统等。因此,改良雷公藤甲素单体剂型、研究新型给药系统以降低其毒性具有十分重要的意义。本文是将雷公藤甲素（简称TP）制备成为雷公藤甲素脂质体（简称TP-LP）,以达到药物缓释的目的,为后续体内增效减毒研究奠定基础。本文分为三部分:第一部分:雷公藤甲素脂质体的处方前研究目的:建立雷公藤甲素脂质体的含量测定方法、测定雷公藤甲素在PBS中的溶解度及筛选包封率的测定方法,为雷公藤甲素脂质体的制备处方筛选、工艺研究、质量研究及体外分析奠定基础。方法:采用紫外-可见全波长扫描测定雷公藤甲素和空白脂质体的最大吸收峰,确定检测波长。采用紫外分光光度法测定雷公藤甲素的含量,建立标准曲线;用紫外分光光度法测定雷公藤甲素在PBS中的溶解度;采用凝胶过滤法、高速离心法、透析法及超滤离心法这四种方法测定TP-LP的包封率,考察方法回收率,并以包封率为指标,进行方法的可行性分析。结果:全波长扫描结果:空白脂质体在202nm有最大吸收,雷公藤甲素在220nm有最大吸收,雷公藤甲素发生显色反应后在540nm有最大吸收;绘制雷公藤甲素在0.1539μg/ml12.467μg/ml浓度范围和1.3852μg/ml112μg/ml浓度范围的标准曲线,浓度与吸光度的线性关系良好,回归方程分别为:A = 0. 0128 C + 0. 0022（ r = 0. 9984 ,n = 5）和A = 0. 0097 C + 0. 02（ r = 0. 998,n = 5）;测定雷公藤甲素在pH 7.0 PBS中溶解度约为21.55μg/ml;四种包封率测定方法对游离药物回收率分别为:107.1%、92.2%、107.8%、95.3%,对脂质体回收率分别为较好、不好、较好、好;结论:对结果分析,雷公藤甲素在220nm处最大吸收与空白脂质体于202nm处最大吸收峰相近,在含量测定中易导致干扰,最终确定540nm作为雷公藤甲素的检测波长;PBS溶解度测定结果表明,雷公藤甲素在PBS中有微量溶解,对包封率测定方法的筛选提供了一定参考;经可行性分析,相对于其他包封率测定方法,超滤离心法对游离药物和脂质体回收率好,因此确定采用超滤离心法测定雷公藤甲素脂质体的包封率。第二部分雷公藤甲素脂质体制备方法筛选及制备工艺的研究目的:以包封率为指标,筛选TP-LP的最佳制备方法;以脂质体粒径、稳定性及包封率为指标优化TP-LP的制备工艺。方法:分别采用薄膜分散法、机械匀浆法、乙醇注入法制备TP-LP,以包封率为衡量指标,采用超滤离心法分离脂质体和游离药物,测定包封率,筛选最佳制备方法;在空白脂质体的制备工艺研究中,以空白脂质体粒径和稳定性为指标,对制备条件:磷脂与胆固醇比例、氯仿用量及超声情况进行优化;在TP-LP制备工艺研究中,以包封率为衡量指标,采用正交优化方法优化影响脂质体包封率的三个制备条件:载药温度、药物与磷脂质量比（药脂比）和载药时间,采用超滤离心法分离脂质体和游离药物,紫外分光光度法测定游离药物含量,计算TP-LP的包封率,筛选最佳制备工艺,并验证最佳条件的准确性。结果:制备方法的筛选中,薄膜分散法、机械匀浆法、乙醇注入法制备TP-LP的包封率分别为:12.7%、14%、13.6%;空白脂质体制备工艺研究中,磷脂-胆固醇比为4:1制备的脂质体稳定性好;超声100w/5min处理的脂质体粒径分布好;用20ml氯仿制备的空白脂质体粒径分布较好。TP-LP制备工艺研究中,经正交优化实验,制备条件:载药温度37℃、药脂比1:50、载药时间60min所制备的雷公藤甲素脂质体包封率最高;最后按最佳优化条件同时制备三批TP-LP,测定其平均包封率为46.4%±0.0295。结论:以包封率为指标,比较三种制备方法,机械匀浆法制备的TP-LP包封率较高,经可行性分析,该方法简单、可重复性好,因此确定机械匀浆法制备TP-LP;空白脂质体单因素优化结果显示,制备最佳条件为:磷脂-胆固醇比例为4:1,超声100w/5min,氯仿用量20ml;TP-LP制备工艺正交优化结果显示,最佳制备条件为载药温度37℃、药脂比1:50、载药时间60min。最佳条件重复验证实验结果验证了正交优化方法的准确性。第三部分雷公藤甲素脂质体的质量研究及体外释药的初步研究目的:对TP-LP进行质量研究,为提高TP-LP稳定性研究奠定基础;进行TP-LP体外药效初步研究,为其体内药效研究奠定基础。方法:按最佳工艺制备TP-LP,用透射电镜显微观察TP-LP形态,用动态光散射仪测定粒径分布,用zeta电位分析仪测定TP-LP的zeta电位,从以上几个指标对脂质体进行质量评价;分别加入不同冻干保护剂制备TP-LP冻干粉,以脂质体冻干粉的外观、复水情况及复水后包封率为衡量指标,筛选最佳冻干保护剂;在体外释药实验,采用透析法分别观察TP和TP-LP的体外释药情况,采用紫外分光光度法测定不同时间点的累计释药量;体外药效实验,用TP、TP-LP处理经PHA活化的人外周血单个核细胞,以MTT法为检测方法,分别于24h、48h、72h测定TP、TP-LP抑制T淋巴细胞增殖的效果。结果:最佳优化工艺制备的TP-LP,粒径范围在40nm250nm之间,平均粒径为89.2nm。粒径对称分布,分散均匀,zeta电位平均值为-67.55mV ,绝对值大于60mv;冻干粉的制备结果,5%蔗糖-甘露醇混合物（w:w=1:1）作为冻干保护剂所制备的冻干粉外观良好,复水过程良好,无肉眼结晶。相对于其他保护剂制备的冻干粉,复水后的包封率下降程度小;TP-LP的体外释药实验结果,44小时后,脂质体中TP全部释放,而游离TP在3h已完全释放;体外药效实验结果显示,24h TP-LP抑制T淋巴细胞增殖效果低于游离的TP;48hTP-LP的抑制效果与游离TP相当;72hTP-LP的抑制效果稍高于游离TP。结论:TP-LP形态、粒径分布基本符合后续研究的要求;zeta电位结果显示,TP-LP稳定性相当好,有利于后续研究;体外释药结果显示,与游离的TP相比,TP-LP有一定的缓释作用;体外药效结果表明,TP经脂质体包裹后具有缓释功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 雷公藤甲素脂质体处方前研究
• （一） 实验仪器与材料
• （二） 实验方法
• （三） 实验结果
• （四） 讨论
• 参考文献
• 第二部分 雷公藤甲素脂质体制备方法筛选及制备工艺的研究
• （一） 实验仪器与材料
• （二） 实验方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 参考文献
• 第三部分 雷公藤甲素脂质体的质量研究及体外释药的初步研究
• （一） 实验仪器与材料
• （二） 实验方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 参考文献
• 综述 脂溶性药物脂质体包封率研究进展
• 参考文献
• 致谢