猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因重组质粒免疫效果的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种严重危害养猪业的传染病,主要引起母猪繁殖障碍和仔猪及生长猪呼吸系统疾病。PRRS病毒（PRRSV）E蛋白是主要的免疫原性蛋白,含有与病毒中和作用相关的表位,在免疫反应中起重要作用。PRRSV E基因被认为是亚单位疫苗、重组活载体疫苗和DNA疫苗的首选基因。为了探讨PRRSV E基因的免疫原性,即研究其是否能刺激机体产生特异性抗体与中和抗体,本研究应用了本实验室构建的表达PRRSV E基因的真核表达质粒pIRES-E,经转化后,大量抽提质粒,并用质粒pIRES-E、空载体pIRESneo、生理盐水和不同剂量的PRRS弱毒苗分别免疫家兔。另外,用PRRS病毒GXA株接种于长成单层的Marc-145细胞,待出现病变后,收获病毒,测其病毒的滴度(TCID50)。本研究挑取18只体重1.5～2.0kg的雄性健康家兔,随机分5组,pIRES-E、空载体pIRESneo组各4只,分别注射质粒200μg/只;生理盐水组4只,注射1mL/只;1/4头份PRRS弱毒苗组3只,注射疫苗0.5 mL/只;1/2头份PRRS弱毒苗组3只,注射疫苗1mL/只,全部后腿肌肉注射,共免疫2次,首免与二免间隔2周。分别于首免前和首免后不同时间点采血,分离血清,用ELISA和中和试验进行特异性抗体和中和抗体的检测,结果表明,免疫pIRES-E质粒组家兔均产生了抗PRRSV E蛋白的特异性抗体,并且有3只家兔检测到了中和抗体。本研究用本实验室构建的PRRSV E基因的真核表达质粒pIRES-E免疫家兔,不但诱导家兔产生了特异性抗E蛋白的抗体,而且产生了中和抗体,进一步验证了PRRSV E基因的免疫原性,并表明重组质粒pIRES-E可诱导机体产生一定的免疫效力,为进一步研制PRRS新型疫苗奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 中英文对照表
• 第一部分 前言
• 1 PRRSV的分类
• 2 PRRSV的基因结构
• 3 PRRSV E蛋白
• 4 PRRS免疫学研究进展
• 5 PRRS的综合防制和疫苗研究进展
• 6 本研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 质粒与细菌
• 1.2 实验动物
• 1.3 细胞系
• 1.4 病毒
• 1.5 引物
• 1.6 试剂及配制
• 1.7 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 实验技术路线
• 2.2 DH5α菌种的复苏
• 2.3 感受态细胞的制备
• 2.4 转化
• 2.5 小量抽提质粒
• 2.6 真核表达质粒pIRES-E的双酶切鉴定和PCR鉴定
• 2.7 重组质粒的大量制备
• 2.8 PRRS病毒GXA株病毒滴度的测定
• 2.9 动物的免疫与分组
• 2.10 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 2.11 微量中和试验（固定病毒—稀释血清法）
• 第三部分 实验结果
• 1 重组质粒pIRES-E的PCR和双酶切鉴定
• 2 重组质粒的大量制备
• 3 PRRS病毒GXA株病毒滴度的测定
• 3.1 细胞毒的RT-PCR鉴定
• 3.2 间接免疫荧光
• 3.3 CPE显微镜观察及照片
• 50)'>3.4 病毒滴度的测定(TCID₅₀)
• 4 联免疫吸附试验（ELISA）
• 4.1 最佳抗原包被稀释度和阴阳血清稀释度的确定
• 4.2 间接ELISA检测免疫后家兔血清中的特异性抗体
• 5 中和抗体水平的检测
• 第四部分 讨论
• 1 关于核酸疫苗
• 2 关于PRRSV的培养
• 3 关于间接ELISA检测方法
• 4 关于PRRSV E蛋白的免疫作用
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况