ROCK-Ⅱ基因表达下调与血管平滑肌细胞迁移的关系

论文摘要

目的动脉粥样硬化严重威胁人类健康,是威胁人类健康的主要原因,在我国动脉粥样硬化的发病率呈逐年增高的趋势。血管平滑肌细胞（VSMC）的增生和迁移,是形成动脉粥样硬化发生的重要因素之一。血小板源性生长因子（PDGF）是一个主要的促细胞分裂原,是引起动脉粥样硬化的主要因素,它的主要作用是促进平滑肌细胞由中层向内层的迁移。PDGF-BB是已知最强的VSMC体外趋化剂。Rho激酶（ROCK）是小G蛋白下游的效应器之一,有两种异构体:ROKα/ROCK-Ⅱ和ROKβ/ROCK-Ⅰ。大量研究表明,RhoA/Rho激酶介导的信号转导通路参与了众多血管生理功能的调节,如细胞骨架重组、平滑肌收缩、细胞增生、黏附和迁移以及其他炎性反应过程,而这些细胞功能又与许多血管疾病的发生和发展密切相关。因此,Rho激酶有望成为治疗动脉粥样硬化、再狭窄、高血压、脑或冠脉血管痉挛等血管疾病的重要靶点。本文旨在探讨ROCK-Ⅱ在血小板源性生长因子（PDGF）诱导的VSMC迁移中的作用。通过应用RNA干扰技术,使ROCK-Ⅱ基因表达下调,从而观察VSMC迁移是否发生变化,进而为探寻平滑肌收缩的分子机制提供实验依据,为临床防治动脉粥样硬化等增生性血管病的新药研发提供新思路。方法1.根据在GenBank中查到大鼠ROCK-Ⅱ基因序列（GenBank NM013022）,自行设计siRNA片段序列,采用化学合成法合成siRNA（编号为CBR0915）。同时,在实验中还使用由本实验室从Santa Cruz公司购置的小鼠ROCK-ⅡsiRNA（sc-36433）。2.采用invitrogen公司的脂质体LipofectamineTM 2000,将siRNA转染至VSMC内,同时使用绿色荧光素标记的Control siRNA（Fluorescein Conjugate）转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染状况,计算转染效率并确定转染时间,通过脂质体毒性实验,确定最佳的转染试剂用量。3.用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA, PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察电泳结果并拍照,分析并计算目的条带与GAPDH扩增条带光密度比值作为其相对表达强度。4.收集细胞,提取总蛋白并测蛋白浓度,电泳转膜后,经过抗体孵育,化学反光法检测蛋白条带,进行灰度值分析,计算ROCK-Ⅱ与β-actin比值。5.采用Boyden小室法进行VSMC的迁移实验,在实验中,设空白对照组（未转染组）、脂质体组（仅加入脂质体组）和RNA干扰组,观察RNA干扰ROCK-Ⅱ基因表达前后A7r5迁移数量的变化。结果1.在荧光显微镜下,观察荧光素标记的Control siRNA转染组细胞,可见到细胞质内清晰的绿色荧光,在转染5小时后,脂质体LipofectamineTM 2000的转染效率接近92%。2.在脂质体毒性实验中,加入1.7μl脂质体使A7r5细胞减少了46.9%,加入2.5μl脂质体使细胞减少了66.2%。3.经过RT-PCR检测,得到如下结果:（1）用小鼠siRNA不能下调ROCK-ⅡmRNA的表达,实验组和对照组相比无显著差异（P>0.05）;（2）用17nM大鼠siRNA可以使ROCK-ⅡmRNA表达量减少了60.3% （P<0.05）。提示大鼠siRNA可以有效抑制ROCK-Ⅱ基因的表达。4. Western blot结果显示:（1）小鼠siRNA不能下调ROCK-Ⅱ蛋白表达,统计学分析显示实验组与对照组相比无显著差异（P>0.05）;（2） 17nM大鼠siRNA可使ROCK-Ⅱ蛋白表达量减少了60.1%。提示大鼠ROCK-ⅡsiRNA可以有效抑制ROCK-Ⅱ蛋白的表达。5. VSMC的迁移实验结果显示:（1）通过不同浓度PDGF-BB诱导A7r5细胞迁移,根据细胞迁移数量,确定了PDGF-BB诱导剂使用浓度为5ng/ml。（2）在A7r5细胞迁移实验中,空白对照组A7r5细胞迁移数为70.2±8.8（1n=3）,脂质体组A7r5细胞迁移数为59.3±6.22 （n=3）,17nM siRNA组A7r5细胞迁移数为60.1±4.11（n=3）。实验表明加入大鼠ROCK-ⅡsiRNA后细胞迁移数量较空白对照组和单纯用脂质体组均未见明显变化。统计学分析显示无显著性差异（P>0.05）。结论1.确定了ROCK-ⅡsiRNA的最佳用量为17nM,最佳转染时间为5小时。2.利用自行设计针对大鼠ROCK-Ⅱ的siRNA转染A7r5血管平滑肌细胞,在基因水平和蛋白质水平进行检测,发现可以有效抑制ROCK-Ⅱ的表达。利用小鼠ROCK-ⅡsiRNA,在基因水平和蛋白质水平进行检测,发现不能抑制ROCK-Ⅱ基因的表达。3.利用Boyden Chamber法进行血管平滑肌细胞迁移实验,初步观察到ROCK-Ⅱ基因表达的下调并未影响血管平滑肌细胞迁移的数量。对于ROCK-Ⅱ是否参与VSMC迁移的过程,有待于今后研究的进一步证实。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料和方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢