复方茵黄解毒汤抗HBV有效部位的活性和成分研究

论文摘要

本课题以复方茵黄解毒汤（茵陈蒿汤+黄连解毒汤）作为研究对象,利用转染乙肝病毒（Hepatitis B Virus,HBV）的2.2.15细胞作为体外药效学模型,对复方茵黄解毒汤主要提取部位的有效活性成分进行体外抗乙肝病毒实验。以体外抗乙肝病毒药效学结果为依据,对其进行药效学跟踪研究,并对活性部位用各种现代分析仪器,研究其指纹图谱。将中药药效组分的指纹图谱定性和有效成分的定量研究相结合,建立复方茵黄解毒汤的在药效学指导下的指纹图谱和质量标准。复方茵黄解毒汤的组方是以茵陈、溪黄草为君药,蒲公英、栀子、黄柏、大黄、黄芩等为臣药,共13味药物组成。其功效为清热利湿退黄、疏肝利胆和胃,主治肝胆湿热证,临床用于治疗各种急、慢性肝炎、胆囊炎等病。本研究采用目前体外抗HBV药物筛选和评价较好地细胞模型2.2.15细胞作为体外抗乙肝病毒的实验模型,探讨复方茵黄解毒汤中对表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的抑制作用。先将复方茵黄解毒汤按极性由低到高分别用三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇分段萃取化学成分,得到各极性段的标准提取物,然后用2.2.15细胞进行体外药理活性筛选各萃取部位的抗HBV活性。通过分析,最终发现了乙酸乙酯提取部位活性较强,其在浓度为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml的HBsAg和HBeAg的抑制率分别为89.12%、85.81%、53.84%、44.31%和82.14%、62.43%、56.35%、44.20%。其抑制率分别高于阳性对照药物干扰素在10×103IU/ml、5.0×103IU/ml、2.5×103IU/ml、1.25×103 IU/ml时的HBsAg和HBeAg的抑制率。干扰素的抑制率分别为50.63%、43.83%、34.79%、21.96%和57.09%、44.20%、32.97%、15.47%。这为开发抗乙肝药物提供了理论依据。采用薄层色谱法（TLC）对复方茵黄解毒汤中有效成分进行鉴别,初步建立复方茵黄解毒汤薄层色谱鉴别方法,选择λs=275nm,λR=365nm双波长扫描与λ=435nm单波长扫描,均为反射法锯齿扫描,Sx=3,Swing Width=10,狭缝0.4mm×0.4mm。对制剂的展开斑点进行全程扫描,对盐酸小檗碱、咖啡酸、阿魏酸、大黄酸的斑点及空白进行部分或全程扫描。比较紫外双波长扫描图谱,得到供试品的扫描图在与盐酸小檗碱标准品峰的位置（约40mm～50mm）、咖啡酸标准品峰的位置（约125mm～135mm）、阿魏酸标准品峰的位置（约145mm～155mm）有相对应的峰。另外,成品在大黄酸的位置（约155mm～165mm）的峰很明显,但大黄标准品由于受前沿溶剂荧光带峰（约165mm～180mm）的影响较大,峰不明显,但还仍可看到由大黄酸引起的肩峰。比较可见光单波长扫描图谱,可见供试品的扫描图在与盐酸小檗碱标准品峰的位置（约40mm～50mm）、大黄酸标准品峰的位置（约160mm～170mm）相对应,空白峰对于大黄酸的影响已消除。采用HPLC法对乙酸乙酯提取部位的有效成分咖啡酸和阿魏酸进行了分析。精密量取复方茵黄解毒汤20 mL置分液漏斗中,用三氯甲烷（20mL）萃取3次,弃去三氯甲烷液,再用乙酸乙酯（20mL）萃取3次,合并乙酸乙酯液,挥干乙酸乙酯,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL,用0.45 um滤膜过滤至样品小瓶中备用,作为供试品溶液。用HypersiL BDS C18作为分析柱,流动相为甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（磷酸调pH为3.7）,得到的峰形较好,并且在18分钟内出峰完全。三个批号的含量分别是咖啡酸:99.76%、100.2%、99.35%和阿魏酸98.64%、101.2%、99.55%;加样回收率的咖啡酸和阿魏酸平均值分别为99.29%、99.38%。结果表明,本方法简单、可靠。可作为复方茵黄解毒汤中咖啡酸和阿魏酸的含量控制的一种有效方法。在此基础上采用毛细管电泳法（HPCE）对其进一步分析。高效毛细管电泳法在现今的药物分析中,比HPLC具有柱效高、分析速度快、进样体积小、易清洗等优点;而且HPCE更适合于直接分析水溶液及未经纯化的样品,不需要消耗大量的高纯有机试剂,节约了运行费用。在同样电泳条件下,测定咖啡酸和阿魏酸对照品,并与复方茵黄解毒汤的HPCE图谱相对比,在8分钟和6分钟的时间段上相对应;同时,采用阳性对照法对样品中咖啡酸和阿魏酸进行定性,确认了8分钟的峰为咖啡酸和6分钟的峰为阿魏酸。采用高效快速、集灵敏度和高选择性于一体的液相色谱-质谱联用技术进行分离分析。通过液相色谱-质谱联用技术获得了液相紫外图谱和总离子流色谱图,并采用MS和LC-MS/MS扫描模式分析,鉴定了其中9个活性成分。分别是:咖啡酸m/z,179为M-H峰,160.9为M-H-OH峰,135为M-COOH-H峰;阿魏酸m/z,233为M+K峰,193为M-H峰,178.3为M-1-CH3峰;大黄酸m/z,283为M-H峰,257为M-CO峰,239.6为M-CO2峰,238.9为M-CO-OH峰:芦荟苷m/z,417为M-H峰,256为M-glu峰,227为256-CO峰;乙酰紫草素M/Z 329.0为M-H峰;木兰花碱M/Z 341.1为M-H峰;原儿茶碱M/Z 136.9为M-H峰;岩白菜素M/Z 327.1为M-H峰;异栀子苷M/Z 403.3为M-H峰。这些活性成分的确定为其临床应用和进一步开发利用提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 复方茵黄解毒汤抗HBV的实验研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 对2.2.15细胞的HbsAg、HbeAg分泌的抑制作用
• 2.4 讨论
• 第三章 复方茵黄解毒汤薄层色谱指纹图谱的初步建立
• 3.1 仪器与试药
• 3.2 方法与结果
• 3.3 讨论
• 第四章 复方茵黄解毒汤乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱定性和有效成分定量研究
• 4.1 仪器与试药
• 4.2 方法与结果
• 4.3 讨论
• 第五章 复方茵黄解毒汤乙酸乙酯部位HPCE指纹图谱定性和有效成分的定量研究
• 5.1 材料和方法
• 5.2 实验结果
• 5.3 讨论
• 第六章 液—质联用技术对复方茵黄解毒汤色谱的指纹图谱分析
• 6.1 材料和方法
• 6.2 实验结果
• 6.3 讨论
• 第七章 结论
• 一 结论
• 二 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 审稿证明