重组大肠杆菌生产肿瘤血管生长抑制因子kringle5发酵条件的优化及纯化

论文摘要

本研究论文通过对重组大肠杆菌生产肿瘤血管生长抑制因子kringle5发酵工艺和纯化工艺的优化,进一步提高kringle5蛋白的表达量,寻找一种简单、快速、分离效果好的纯化工艺。本论文的研究工作将为kringle5蛋白的大规模生产和临床应用奠定基础。 本研究论文在构建融合型肿瘤血管生长抑制因子kringle5原核表达系统的基础上,通过改变培养基中氮源的种类和含量、无机盐的种类和含量以及碳氮比,确定了最合适的培养基为（g/L）:酵母提取物10,NH4Cl 1.33,NaH2PO42,Na2HPO45,MgSO4·7H2O 1,葡萄糖6。采用优化后的培养基,通过正交实验,对重组菌的发酵工艺进行了优化,优化后的重组菌发酵条件为:温度35℃,pH7.0,接种量8%,摇床转速260r/min,诱导剂浓度0.8 mmol/L,诱导时机OD6000.6,诱导时间6h。摇瓶发酵的七个因素中,溶液中诱导剂的浓度是最显著的影响因素,诱导时间、诱导时机、温度、pH、摇床转速的影响次之,而接种量的影响不显著。通过发酵罐中重组菌的分批培养,确定了培养液中的最佳溶氧量为40%。采用优化后的发酵工艺,在20L发酵罐中kringle 5蛋白的表达量可达0.59g/L。采用Cu2+螯合的Sepharose Fast Flow柱和CM Sepharose CL-6B阳离子柱两步层析对蛋白进行了纯化,kringle5蛋白的最终纯度为96%,得率为0.3%。通过鸡胚绒毛尿囊膜法证明kringle5蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管增生有一定的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• Ⅰ文献综述
• 1 肿瘤的生长、转移与血管生成的关系
• 1.1 肿瘤的生长过程
• 1.2 肿瘤的转移机制
• 1.3 肿瘤的生长、转移与血管生成的关系
• 2 肿瘤血管生长抑制因子与肿瘤的抗血管生成疗法
• 2.1 肿瘤血管生长抑制因子
• 2.2 肿瘤的抗血管生成疗法
• 3 肿瘤血管生长抑制因子kringle5
• 3.1 肿瘤血管生长抑制因子kringle5的结构
• 3.2 Kringle5抑制血管增生的分子机制
• 3.2.1 K5与内皮细胞的迁移、增殖和凋亡
• 3.2.2 K5与血管增生平衡
• 3.2.3 K5与炎性反应
• 3.3 Kringle5对血管增生性疾病治疗的实验研究
• 3.4 Kringle5的基因工程药物开发及应用
• 4 本研究的意义
• 5 研究开发的方向和重点
• Ⅱ 实验部分
• 1 试剂与仪器
• 1.1 试剂
• 1.2 菌株及质粒
• 1.3 培养基
• 1.4 仪器
• 2 工艺研究
• 2.1 发酵工艺的优化
• 2.1.1 培养基的优化
• 2.1.2 工程菌生长曲线的确定
• 2.1.3 摇瓶发酵工艺的优化
• 2.1.4 发酵罐分批培养溶氧的确定
• 2.1.5 发酵罐中分批培养
• 2.2 K5蛋白的纯化
• 2+螯合的Sepharose Fast Flow层析'>2.2.1 Cu²+螯合的Sepharose Fast Flow层析
• 2.2.2 Sephadex G25柱层析
• 2.2.3 CM Sepharose CL 6B阳离子交换层析
• 3 分析与检测
• 3.1 菌体浓度的测定
• 3.2 葡萄糖浓度测定
• 3.3 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.3.1 样品处理
• 3.3.2 SDS-PAGE电泳条件
• 3.4 蛋白浓度分析
• 3.5 K5生物活性测定
• Ⅲ 结果与讨论
• 1 工艺研究结果与讨论
• 1.1 发酵工艺的优化
• 1.1.1 培养基的优化
• 1.1.2 工程菌生长曲线的测定
• 1.1.3 摇瓶发酵工艺的优化
• 1.1.4 发酵罐分批培养溶氧的确定
• 1.1.5 发酵罐中分批培养
• 1.2 K5蛋白的纯化
• 2+螯合的Sepharose Fast Flow层析'>1.2.1 Cu²+螯合的Sepharose Fast Flow层析
• 1.2.2 Sephadex G25柱层析
• 1.2.3 CM Sepharose CL 6B阳离子交换层析
• 2 分析与检测实验结果与讨论
• 2.1 葡萄糖浓度测定
• 2.2 SDS-PAGE凝胶电泳
• 2.3 纯化K5溶液蛋白浓度测定
• 2.4 K5活性测定
• Ⅳ 结论
• 1 结论
• 2 存在的主要问题
• 致谢