淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

论文摘要

目的：本实验在体外成功原代培养人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）的基础上,将含不同浓度淫羊藿苷（icariin,ICA）的矿化诱导培养液与其作用,通过检测其增殖,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）等骨相关特征性指标,以期明确淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响。方法：1.采用胰酶消化玻片覆盖组织块法体外原代培养人牙周膜细胞,相差倒置显微镜观察其形态学特征,采用每日细胞计数法绘制细胞生长曲线；2.波形丝蛋白、角蛋白免疫细胞化学染色鉴定原代培养的人牙周膜细胞来源；3.在矿化诱导条件下培养人牙周膜细胞21d,行茜素红染色,以是否形成钙化结节评价其是否具有骨向分化能力；4.在矿化诱导条件下将浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml的淫羊藿苷与人牙周膜细胞作用24h、48h、72h,采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）评价淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖的影响；5.在矿化诱导条件下将浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml的淫羊藿苷与人牙周膜细胞作用72h,通过检测ALP活性,Elisa法检查BSP、OCN的表达水平,评价其对人牙周膜细胞骨向分化的影响。结果：1.胰酶消化玻片覆盖组织块法可成功原代培养人牙周膜细胞,生长曲线可见,接种后24-48h,细胞数目有所减少,第3d细胞开始增殖,逐渐进入指数增殖期,接种后第7d,细胞数目达到最大值,第8d开始,细胞进入平台期。整个生长曲线呈现“S”形。按公式计算,得出细胞倍增时间约为90h。2.原代培养人牙周膜细胞免疫细胞化学染色,波形丝蛋白染色阳性,表现为胞质棕黄色着色；角蛋白染色阴性,未见着色,说明是中胚层来源细胞。3.矿化诱导培养第14d时,观察到细胞群中出现灰白色结节,随时间增长逐渐增大增多。第21d时结束培养行茜素红染色后可见,矿化诱导培养组形成多处红染矿化结节,而对照组仅可见到极少数红染矿化结节,原代培养的人牙周膜细胞可在矿化诱导条件下骨向分化：4.淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖的影响：淫羊藿苷作用24h时,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖（P<0.05）。作用48h时,1-0.001μg/ml组可明显增强人牙周膜细胞增殖能力（P<0.05）,10μg/ml组OD值较对照组小,但差异无统计学意义（P>0.05）。作用72h时,0.1-0.001μg/ml组可促进人牙周膜细胞增殖（P<0.05）,10μg/ml组与对照组相比抑制了牙周膜增殖（P<0.05）；5.淫羊藿苷对人牙周膜细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的影响：淫羊藿苷在矿化诱导条件下与人牙周膜细胞作用72h时,发现1-0.001μg/ml组可促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶（ALP）活性（P<0.05）,而10μg/ml组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；6.淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨涎蛋白（BSP）表达水平的影响：淫羊藿苷与人牙周膜细胞在矿化诱导条件下作用72h后,0.1～0.001μg/ml组的BSP表达水平均较对照组显著增加（P<0.05）。1 u g/ml与10μg/ml组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。7.淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素（OCN）表达水平的影响：人牙周膜细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作用72h后,1～0.01μg/ml组的OCN表达水平均较对照组显著增加（P<0.05）,0.001μg/ml组的OCN表达水平较对照组高,但无统计学意义（P>0.05）,10μg/ml组OCN表达水平较对照组低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.胰酶消化玻片覆盖组织块法可成功原代培养人牙周膜细胞,培养周期短、成功率高,其来源可靠,细胞生长状态良好；2.人牙周膜细胞中具有可骨向分化的细胞群；3.一定浓度的淫羊藿苷可促进人牙周膜细胞增殖和骨向分化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 人牙周膜细胞原代培养
• 前言
• 实验材料与仪器
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响
• 前言
• 实验材料与仪器
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在学期间研究成果
• 致谢
• 附录