论文摘要
目的：大多数恶性实体肿瘤包括卵巢癌的生长及转移依赖于新生血管的形成，肿瘤微血管密度与其恶性程度和生物学特性密切相关。大部分的卵巢癌患者发现时已属晚期，由于卵巢癌组织学的复杂性和诊疗的困难，使其成为妇科领域的主要研究课题。尽管肿瘤手术治疗与化疗联合治疗有一定疗效，但广泛的盆腹腔肿瘤转移使手术难以将肿块切除干净，其复发率和死亡率仍较高。目前其治疗方法虽多，但5年生存率尚无明显改善。因此需探讨一种新的治疗理念和方法，以期改善卵巢癌的预后。以肿瘤的新生血管为靶向的抗血管生成治疗，已成为治疗肿瘤的一种新途径，内皮抑素（Endostatin）是ⅩⅧ型胶原C-末端分子量约20KD的片段，由184个氨基酸组成，是内源性血管抑制因子，能特异地抑制血管内皮细胞的生长，从而有效地抑制肿瘤新生血管的形成，它被公认为是目前最有效的血管生成抑制剂。而阳离子脂质体（Cationic liposome，lipo）具有高度的生物靶向性，长效缓释性，能够降低被包裹抗原的毒性，增强动物耐受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力，其在血液中驻留时间延长、作用持久，可有效到达病变部位，提高靶向组织的选择性。阳离子脂质体与腺病毒形成复合物后，可有效地提高腺病毒在柯萨奇-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）低表达的肿瘤细胞株的转染效率，保护腺病毒不被中和抗体作用，提高其作用效果。在本研究中，我们采用复制缺陷型腺病毒作为载体，构建了表达入内皮抑素的重组腺病毒（Ad-hEndo）并用阳离子脂质体包裹形成复合物，将复合物通过静脉注射入荷卵巢癌裸鼠体内，观察其靶向抗卵巢癌作用，并对其作用机制进行初步探讨。方法：（1）阳离子脂质体的制备二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、N-[1-（2，3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA）、胆固醇（CHOL）比例为1：1：0．1。用三氯甲烷和甲醇的有机溶液溶解，旋转蒸发后，不超过40℃温度下，真空干燥2小时，加入灭菌水，在氮气保护下，超声破碎即得阳离子脂质体。（2）阳离子脂质体-腺病毒复合物的制备将重组绿色荧光蛋白腺病毒（Ad-GFP）与不同浓度的阳离子脂质体混匀后制备成复合物在室温下放置20分钟后待用。（3）在透射电镜下观察阳离子脂质体-腺病毒复合物形态。（4）优化实验：不同浓度阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒（lipo+Ad-GFP）复合物转染人卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）细胞株，流式细胞术（FACS）测定其转染效率，确定优化比例。（5）用阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒（Ad-hEndo）复合物转染SKOV3细胞株，Western blot鉴定。（6）检测尾静脉注射阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物在裸鼠肿瘤组织内不同时段的表达。（7）尾静脉注射阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物抗肿瘤效果实验观察建立BALB／c裸鼠卵巢癌（SKOV3）动物肿瘤模型，将荷瘤裸鼠随机分为6组，即生理盐水组、单脂质体组、阳离子脂质体-未重组的腺病毒空载体组、重组人内皮抑素腺病毒组、阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物高剂量治疗组（200μg脂质体+1×109pfu重组人内皮抑素腺病毒）、阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物低剂量治疗组（20μg脂质体+1×108pfu重组人内皮抑素腺病毒）。观察阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物对肿瘤生长的影响，通过测量肿瘤体积、肿瘤重量、免疫组化检测微血管密度、原位缺如末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡探讨抗肿瘤作用。（8）体外实验：阳离子脂质体-腺病毒复合物对中和抗体作用的观察。重组绿色荧光蛋白腺病毒和阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物分别与倍比稀释的抗腺病毒抗体血清37℃孵育90分钟，之后再分别转染SKOV3细胞，24小时后荧光显微镜下评价抗体中和活性。结果：（1）透射电镜下显示，经处理的阳离子脂质体多为圆形或椭圆形多层小囊泡形态，大小在80～100nm之间，分布均匀，没有跨距；腺病毒颗粒散在或聚集成堆，呈球状；腺病毒颗粒被阳离子脂质体均匀包裹，包被在腺病毒颗粒外的阳离子脂质体呈多层洋葱片样结构。（2）阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物的优化实验结果得出，阳离子脂质体：重组绿色荧光蛋白腺病毒的最佳比例为10μg：5×107pfu，此研究结果用于进行下一步实验。（3）Western blot分析显示重组人内皮抑素腺病毒转染的SKOV3细胞裂解液可与抗内皮抑素的标准抗体发生反应，在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上形成一条与预期蛋白分子量一致的条带，表明重组腺病毒在体外转染细胞能够正确表达所需目的蛋白。（4）阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物在裸鼠肿瘤内的表达实验表明：实验组（Lipo+Ad-GFP）不同时段均发现有GFP基因的表达，其中以48及72小时表达情况较强，96小时后仍有较强表达。而对照组（Ad-GFP）各时段肿瘤组织内荧光表达较少。（5）尾静脉注射阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物抗肿瘤效果观察在BALB／c裸鼠卵巢癌动物模型中，观察到：治疗组裸鼠的肿瘤生长明显减缓且肿瘤重量减轻，阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物高剂量治疗组、阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物低剂量治疗组的肿瘤瘤重抑制率分别为54．74％，70．65％，与NS组比较有统计学意义（P＜0．05）。免疫组织化学及TUNEL观察到：两复合物治疗组裸鼠肿瘤组织中，凋亡细胞增多，微血管数减少，与NS组比较有统计学意义（P＜0．05）。而治疗组中，低于10倍剂量的阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物（1×108pfu／只）即可达到甚至超过重组人内皮抑素腺病毒（1×109pfu／只）的作用效果。（6）体外中和抗体实验表明：实验组：阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物与倍比稀释的抗腺病毒抗体血清孵育后转染SKOV3细胞，荧光结果显示：加入不同浓度的腺病毒中和抗体均不能降低阳离子脂质体-重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物的感染效果，阳离子脂质体可以有效地保护腺病毒不被中和抗体作用，仍然维持其感染活性；对照组：单独重组绿色荧光蛋白腺病毒由于抗体中和作用感染活性明显下降。结论：1．阳离子脂质体可均匀包裹腺病毒。2．采用的重组人内皮抑素腺病毒在体外能够表达目的蛋白。3．阳离子脂质体包裹重组绿色荧光蛋白腺病毒复合物可明显提高转染效率。4．在人卵巢癌动物模型中，阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物能有效抑制肿瘤的生长，而且，低剂量组的抑瘤效果可达到高剂量组，因此可以通过降低重组腺病毒—阳离子脂质体复合物的使用剂量，降低毒副作用的同时达到较好治疗效果。5．阳离子脂质体可以有效地保护腺病毒不被中和抗体作用，仍然维持其感染活性，为重复注射腺病毒制剂而避免被抗体中和降低药效提供理论基础。6．阳离子脂质体-重组人内皮抑素腺病毒复合物靶向抗血管生成的基因治疗有望成为治疗卵巢癌的有效方法之一，为临床综合治疗卵巢癌提供新思路，值得进一步研究。
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