用于引导RNaseP切割HCMV UL54基因mRNA片段的EGS的体外筛选

论文摘要

RNase P是一种核蛋白复合物,它可以在体内特异性地剪切tRNA前体（ptRNA）的5’末端,形成成熟的tRNA。大肠杆菌来源RNase P包括一个377nt的RNA催化活性单位（M1 RNA）和一个约119氨基酸的碱性蛋白（C5）,二者均为RNase P体内活性所必须。在缺乏C5蛋白的体外环境下,M1 RNA可在高盐溶液中具备对底物RNA进行催化切割的活性。外部引导序列（External Guide Sequence,EGS）是能与底物mRNA互补的小片段RNA,只要二者形成类似ptRNA分子的复合物,M1 RNA即可对该复合物双链互补区域进行特异切割。 本课题以人类巨细胞病毒（HCMV）UL54基因mRNA片段为靶序列,从13个适合EGS互补的靶序列中,选择4个已经证明可以被M1GS核酶特异切割、并且切割活性较高的靶序列作为研究对象,设计特异性与靶序列部分互补形成茎环结构的EGS,研究M1 RNA在EGS引导下对UL54基因mRNA片段的切割作用。EGS与M1 RNA、底物均由T7启动子起始转录,分别获得RNA-based EGS、M1 RNA和α-32PUTP放射性标记的底物RNA片段。将底物RNA片段、M1 RNA与对应的RNA-based EGS在特定的体外切割缓冲液中混合反应,通过同位素扫描筛选到3个具备特异切割活性的RNA-based EGS。改变EGS的化学性质,人工合成4个与RNA-based EGS序列相同的DNA-based EGS,筛选出相同的3个具备特异引导切割的活性。 采用不同的Mg2+浓度进行体外切割反应,100mmol/L MgCl2和200mmol/LMgCl2时切割效率无显著差异,表明切割反应对Mg2+浓度的要求可能有更低的域值。 我们的研究成功利用两种不同化学性质的EGS引导大肠杆菌来源RNase P催化亚单位M1 RNA,实现了对HCMV UL54基因mRNA片段的特异性切割,并筛选出若干有效的EGS,为RNase P/EGS技术的胞内研究奠定了基础,证实了RNase P在抗病毒方面的应用价值。

论文目录

• 一 前言
• 1 核酶的发现及其意义
• 1.1 RNase P简介
• 1.2 大肠杆菌来源RNase P的组成
• 1.3 M1 RNA的高级结构特征
• 1.4 M1 RNA与底物的作用模式
• 1.5 金属阳离子对M1 RNA体外切割活性的影响
• 1.6 EGS与M1GS
• 1.7 DNA-based EGS
• 2 HCMV简介
• 2.1 HCMV的命名
• 2.2 HCMV的病毒学特征
• 2.3 HCMV的感染特点
• 2.4 HCMV的致病机制
• 2.5 HCMV的危害
• 2.6 DNA聚合酶UL54基因简介
• 3 课题意义
• 二 技术路线
• 三 材料和方法
• 1 主要仪器
• 2 实验材料
• 2.1 质粒和菌种
• 2.2 寡核苷酸片段
• 2.3 主要试剂
• 2.4 其它主要试剂的配方
• 3 实验方法
• 3.1 底物UL54基因片段的选择及转录模板的获得
• 3.1.1 底物UL54基因C片段克隆和D片段克隆的鉴定
• 3.1.2 底物UL54基因C片段和D片段转录模板的线性化
• 3.2 M1 RNA核酶转录模板的获得
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 PCR扩增M1 RNA
• 3.2.3 pUC19质粒载体的制备
• 3.2.4 对M1 RNAPCR产物和载体双酶切、连接
• 3.2.5 制备感受态宿主菌
• 3.2.6 转化大肠杆菌
• 3.2.7 转化子的筛选、鉴定和测序
• 3.2.8 pUC19-M1 RNA亚克隆质粒的制备
• 3.2.9 M1 RNA核酶转录模板的线性化
• 3.2.10 M1 RNA线性模板的末端平滑处理
• 3.3 EGS的设计与体外转录模板的获得
• 3.3.1 RNA-based EGS的获得
• 3.3.1.1 RNA-based EGS的克隆
• 3.3.1.1.1 EGS DNA的合成
• 3.3.1.1.2 pUC19质粒载体的制备、双酶切和去磷酸化处理
• 3.3.1.1.3 将含有T7启动子的EGS DNA片段与pUC19载体连接
• 3.3.1.1.4 制备感受态宿主菌
• 3.3.1.1.5 转化
• 3.3.1.1.6 转化子的筛选、鉴定和测序
• 3.3.1.2 pUC19-EGS克隆质粒的制备
• 3.3.1.3 EGS转录模板的线性化
• 3.3.1.4 EGS线性模板的末端平滑处理
• 3.3.2 DNA-based EGS的设计与合成
• 3.4 RNA Marker模板的制备
• 3.4.1 确定RNA Marker的材料来源
• 3.4.2 RNA Marker DNA模板的制备
• 3.5 体外转录
• 3.5.1 底物UL54基因小片段的体外转录
• 3.5.1.1 UL54基因C片段和D片段预转录
• 3.5.1.2 对UL54基因C片段和D片段进行同位素标记的体外转录
• 3.5.2 M1 RNA核酶的体外转录
• 3.5.3 EGS的体外转录
• 3.5.4 RNA Marker的体外转录
• 3.5.5 体外转录产物的检测
• 3.6 EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割实验
• 3.6.1 RNA-based EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割
• 3.6.2 DNA-based EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割
• 2+浓度下EGS引导M1 RNA对底物RNA片段体外切割的比较'>3.6.3 不同Mg²⁺浓度下EGS引导M1 RNA对底物RNA片段体外切割的比较
• 3.7 凝胶电泳与同位素扫描
• 3.7.1 凝胶电泳
• 3.7.1.1 凝胶的制备
• 3.7.1.2 电泳条件
• 3.7.1.3 电泳后处理
• 3.7.2 压屏处理
• 3.7.3 同位素扫描
• 四 结果与分析
• 1 克隆质粒PU54-C和PU54-D的构建与鉴定
• 1.1 底物UL54基因小片段的克隆方案
• 1.2 PU54-C质粒的双酶切鉴定
• 1.3 PU54-D质粒的双酶切鉴定
• 2 M1 RNA亚克隆质粒pUC19-M1 RNA的鉴定
• 2.1 载体的选择
• 2.2 pUC19-M1 RNA克隆质粒的鉴定
• 3 pUC19-EGS克隆质粒的鉴定
• 3.1 载体的选择
• 3.2 EGS靶位的确定
• 3.3 EGS的设计
• 3.4 pUC19-EGS克隆质粒的鉴定
• 4 体外转录结果
• 4.1 底物RNA体外转录产物的电泳检测结果
• 4.2 M1 RNA核酶体外转录产物的电泳检测结果
• 4.3 各RNA-based EGS体外转录产物的电泳检测结果
• 5 体外切割产物的电泳检测结果
• 5.1 体外切割产物的理论预计
• 5.2 体外切割产物电泳检测结果
• 5.2.1 RNA-based EGS引导M1 RNA对底物的切割
• 5.2.2 DNA-based EGS引导M1 RNA对底物的切割
• 5.2.3 DNA-based EGS与RNA-based EGS引导M1 RNA对底物切割的比较
• 2+浓度对M1 RNA切割效率的影响'>5.2.4 不同Mg²⁺浓度对M1 RNA切割效率的影响
• 6 EGS的体外筛选
• 五 讨论
• 1 EGS的设计
• 2 M1 RNA体外切割活性的影响因素
• 2.1 底物片段
• 2.2 底物、核酶与EGS的比例
• 2.3 金属阳离子
• 2.4 分子热运动
• 六 结论
• 七 附录
• 附录1 pUC19-M1 RNA重组质粒测序结果（序列+图谱）
• 附录2 GENEBANK公布M1 RNA基因全序列
• 附录3 pUC19-T4EGS、pUC19-C6EGS、pUC19-T6EGS、pUC19-T7EGS重组质粒测序结果（序列+图谱）
• 八 参考文献
• 九 致谢