模拟体内应激因素对胸膜肺炎放线杆菌重要毒力基因表达影响的研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumonia,APP）引起的一种猪呼吸道传染病,世界各国均有发生。近年来,该病在我国的发生呈现逐年上升趋势,给我国养猪业造成了严重的经济损失。目前,对APP的致病机理研究已成为研究的热点和难点之一。本研究模拟体内多个应激因素,开展了对胸膜肺炎放线杆菌重要毒力基因表达影响的研究,从分子水平上进一步对APP的毒力基因表达差异进行了研究分析,主要研究内容如下:1.APP培养条件优化及模拟应激模型的建立在多个固体培养基和液体培养基中观察APP血清1型4074株生长特性,筛选出适合APP生长的最佳固体培养基和液体培养基。在此基础上,依据感染过程中胸膜肺炎放线杆菌可能向临的应激环境,设计并实施了四个体外模拟应激条件:高温（40、41、42℃）、氧化应激（1 mmol/L H2O2）、低铁应激（200μmol/L、300μmol/L、500μmol/L、1mmol/L Na3CaDTPA）、酸性应激（pH7.0、6.6、6.2、5.8）。在上述四种应激模型中,采用体外培养APP血清1型4074株10、20、30、40、60 min。通过对七述各应激条件的摸索和筛选,建立了APP侵入宿主引起感染的最佳体内环境应激模型:高温（41℃）、氧化应激（1 mmol/L H2O2）、低铁应激（200μmol/L Na3CaDTPA）、酸性应激（pH5.8）。应激诱导时间分别为10、30、60 min。上述模型可以用以模拟APP在宿主体内的感染环境和细胞生长环境。2.APP重要毒力基因表达谱芯片靶基因的扩增及克隆根据APP血清1型重要毒力基因,以ArrayDesigner 2.0软件设计APP的重要毒力靶基因引物。试验以APP血清1型（4074株）菌核酸为模板,分别以设计的31对引物进行PCR扩增。试验共扩增了APP的30个待研究毒力基因和1个看家基因,并克隆到pMD18-T载体中。其中5个为APP编码毒素蛋白基因:apxIA（358 bp）、apxIC（322 bp）、apxID（465 bp）、aprIIA（452 bp）、apxIVA（346 bp）,6个为APP编码外膜蛋白基因:omlA（474 bp）、palA（408 bp）、cpsIC（603 bp）、afuA（446 bp）、apaA（493 bp）,8个为APP毒力代谢基因:guaA（499 bp）、dsbA（493 bp）、ureC（552 bp）、ohr（405 bp）、sodC（506 bp）、sodA（459 bp）、dsbE（374 bp）、fumB（452 bp）、oxygen-sensitive（434 bp）,3个为APP应激调控基因:mopA（528 bp）、mopB（400 bp）、dnaK（325 bp）,7个为APP转运相关基因:dmsA（528 bp）、hgbA（562 bp）、tbpB（511 bp）、tbpA（592 bp）、fhuD（561 bp）、exbB2（318 bp）、glyA（456 bp）,1个为APP看家基因recF（319 bp）和1个为APP未知功能基因arcA（443 bp）。对克隆的31个靶基因质粒进行PCR鉴定、序列测定和比对,电泳结果显示提取的质粒和PCR产物保持了较好的纯度和均一性,Blastn比对结果表明扩增克隆的各基因序列与GenBank中APP同型参考序列同源性均在95%以上。APP靶基因的克隆与鉴定为APP重要毒力基因表达谱芯片的构建提供了准确可靠的基因材料。3.APP重要毒力基因表达谱芯片的构建3.1 APP重要毒力基因表达谱芯片荧光探针制备采用MasterPureTM RNA Purification Kit试剂盒分别提取高温（41℃）、氧化应激（1 mmol/L H2O2）、低铁应激（200μmol/L Na3CaDTPA）、酸性应激（pH5.8）四种应激模型中诱导不同时间点（10 min、30 min和60 min）的菌液总RNA和对照组菌液总RNA,本试验抽提的总RNA OD260/OD280值在1.72～2.19之间,18s和28s电泳条带清晰,纯度和完整性符合试验要求。将总RNA逆转录生成氨基标记cDNA并纯化,进行荧光素标记（Cy3和Cy5）,纯化后的cDNA用作表达谱芯片荧光探针。为了测定并降低统计误差,将对照组和实验组总RNA分别用Cy3-dCTP及Cy5-dCTP进行标记和杂交。本试验成功制备了24份可用于APP重要毒力基因表达谱芯片制作的荧光探针。3.2 APP重要毒力基因表达谱芯片的制备用点样仪SpotArray 24将制备好的浓度为300 ng/μL的靶基因点制于氨基化玻片,点阵有14行,15列,每个靶基因5个点,点间距为300μm,点直径约为120μm。点样环境湿度45%,温度22℃。点制好的基因芯片通过紫外线交联和洗涤处理,使靶基因牢固固定于玻片表面,并阻断非特异性结合位点,提高杂交效率。探针和靶基因在42℃预杂交5 h后杂交16 h,洗涤干燥后用ScanArray（?）扫描仪进行扫描分析。芯片杂交结果显示芯片的背景低,杂交点清晰,杂交点均匀而圆滑。提示本批次芯片在制备的各个环节均达到了质量要求,可以应用于相关研究。3.3模拟体内应激环境FAPP重要毒力基因表达研究通过杂交、扫描、统计学分析,根据q-value及Ratio值从30个待研究毒力基因中筛选出差异表达基因,其中高温应激10 min、30 min、60 min分别有3个（tbpA、tbpB和hgbA）、1个（acrA）和1个（apaA）基因表达上调,2个（afuA和dmsA）、2个（afuA和dmsA）和2个（apxIIA和afuA）基因表达下调;氧化应激10 min、30 min、60 min分别有1个（exbB2）、5个（ohr、apxIA、dsbE、tbpA和,tbpB）和5个（exbB2、hgbA、tbpA、tbpB和sodA）基因表达上调,7个（glyA、omlA、afuA、apxIA、apxIC、dmsA和sodC）、1个（apaA）和5个（exbB2、hgbA、tbpA、tbpB和sodA）基因表达下调;低铁应激10 min、30 min、60 min分别有13个（apxID、apxIIA、mopA、mopB、hgbA、tbpA、exbB2等）、7个（hgbA、tbpA、tbpB等）和7个（hgbA、tbpA、tbpB等）基因表达上调,3个（dmsA、afuA和oxygen）、2个（dmsA、afuA）和5个（dnaK、fumB等）基因表达下调;酸性应激10 min、30 min、60 min分别有0个、3个（dnaK、afuA和dmsA）和3个（dsbE、ureC、arcA）基因表达上调,3个（dnaK、afuA和dmsA）、1个（afuA）和3个（omlA、oxygen、dnaK）基因表达下调。根据上述基因差异表达结果,本试验进行了基因转录调控网络构建,在四种应激模型调控网络中分别筛选出各个调控网络的关键基因,它们分别是exbB2（高温应激）,apxIVA、dsbE、mopB、sodC（氧化应激）,apxID、dsbE、exbB2（低铁应激）,fhuD、ureC（酸性应激）。这些关键调控基因的筛选有助于药物靶标的筛选和个性化药物的设计,为后续研究奠定了坚实的基础。试验采用统计学分析方法对APP重要毒力基因在四个应激模型下共转录基因进行分析,预测了胸膜肺炎放线杆菌该组毒力基因在四个应激模型下的表达趋势,在高温应激下,大多数待研究APP毒力基因一直表现为转录下调:在氧化应激早期,大多数待研究基因转录上调,在应激中期,转录上调水平高于早期,大多数基因的转录调节水平趋近峰值,在应激晚期,部分基因转录上调水平出现下降趋势。结果表明APP毒力基因的表达在高温和氧化应激下具有时间特异性。用荧光定量PCR技术对其中4个基因（tbpA、apaA、apxIVA和arcA）的表达差异进行了验证,所选取的基因荧光定量PCR相对定量结果与芯片检测结果基本趋势一致。通过验证,表明表达谱芯片的杂交结果真实可靠,为下一步继续研究差异表达基因和了解APP致病机理打下了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一篇 文献综述
• 第一章 胸膜肺炎放线杆菌研究进展
• 1. 胸膜肺炎放线杆菌的概述
• 2. 胸膜肺炎放线杆菌的病原学
• 3. 流行病学
• 4. 临床症状和病理变化
• 5. 传染性胸膜肺炎的危害
• 6. 胸膜肺炎放线杆菌致病机制研究现状
• 7. 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究进展
• 第二章 表达谱基因芯片技术研究进展
• 1. 表达谱基因芯片的概念
• 2. 表达谱基因芯片的原理
• 3. 表达谱基因芯片的分类和技术流程
• 4. 表达谱基因芯片在基因组研究中的优点
• 5. 表达谱基因芯片在动物基因组学研究中的应用
• 6. 表达谱基因芯片存在的问题及展望
• 第三章 DNA芯片转录谱技术在微生物基因调控研究中的应用
• 1. 细菌 DNA芯片转录谱技术的基本步骤及原理
• 2. 体外 DNA芯片转录谱研究的意义
• 3. 体外 DNA芯片转录谱用于微生物基因调控方面的研究
• 前言
• 第二篇 研究内容
• 第一章 APP培养条件优化及模拟应激模型的建立
• 1. 研究目的和意义
• 2. 材料和方法
• 3. 结果与分析
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 第二章 APP重要毒力基因表达谱芯片靶基因的扩增及克隆
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果与分析
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 第三章 APP毒力基因表达谱芯片构建及模拟环境下基因表达影响研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果与讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附件1 主要试验试剂配制
• 附件2 攻读学位期间发表的学术论文目录