理想株型IPA1基因转化籼稻的分子育种研究

论文摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。近年来,随着世界人口的增长,耕地面积逐年减少,对粮食的需求也越来越大,粮食安全问题日益严峻。株型是决定作物产量的关键因素,因此开展水稻理想株型的相关研究具有重要的现实意义。本研究旨在通过农杆菌介导法,将水稻理想株型基因IPA1导入籼型恢复系“明恢86”中,期望从中筛选出少蘖秆壮穗大抗倒伏的理想株型材料,最终实现水稻的超高产。围绕此目的,本研究取得的主要研究结果如下：1.利用农杆菌介导法,将载体PHIMES-Ubi-IPA1导入籼型恢复系“明恢86”中,获得132株抗性植株,PCR检测表明,其中64株转化植株可以检测到标记基因bar,初步说明携带IPA1基因的T-DNA结构已经整合到籼型恢复系“明恢86”的基因组中。2.从PCR检测为阳性的转基因植株中随机挑取5株进行Southern blot杂交检测,结果表明有3株检测到杂交信号且为单拷贝。3.随机选取6株转基因植株,分别提取RNA,进行RT-PCR分析,结果表明,6株转基因植株均可扩增出一条436bp的目的条带,说明T-DNA结构中的转基因能够在mRNA水平上稳定表达。4.结合Real time PCR,比较了转基因植株和对照植株中IPA1基因的表达情况。结果表明：IPA1在大多数转基因植株（根、茎、叶）的表达量均比对照高；组织表达特异性分析发现该基因在茎中的表达量最高,其次是叶,在根中最低。5.对T0代转基因植株茎秆的相关生理指标进行测定,结果表明,转基因植株的株高、分蘖数、基部以上各节间长度均低于对照,但其叶绿素含量却略高于对照；转基因植株茎秆及叶片中的纤维素含量、木质素含量、钾含量、硅含量均显著高于对照,而半纤维素含量却低于对照。6.对T1、T2代转基因植株分别进行PPT抗性筛选和HPT抗性筛选试验,并通过PCR检测证实了方法的可行性。7.对转基因植株茎秆横截面进行扫描电镜分析,结果表明,转基因植株小维管束外侧皮层纤维细胞的层数明显多于对照植株,并且转基因植株茎秆厚壁组织细胞的细胞腔较小,壁厚,其木质化程度明显高于对照植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 本项目的研究背景及立题依据
• 1.2 水稻理想株型的概念及其研究现状
• 1.2.1 理想株型概念的提出
• 1.2.2 影响水稻株型的因素
• 1.2.3 水稻株型的研究现状
• 1.3 国内外水稻抗倒伏性研究进展
• 1.3.1 株高与倒伏
• 1.3.2 茎秆性状与倒伏
• 1.3.2.1 茎秆的农艺性状与倒伏关系
• 1.3.2.2 茎秆解剖结构与倒伏关系
• 1.3.2.3 茎秆化学成分与倒伏关系
• 1.4 水稻愈伤组织快速诱导的研究
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒与菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 转基因水稻苗的产生
• 2.2.1.1 培养基
• 2.2.1.2 愈伤组织的诱导与继代
• 2.2.1.3 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2.2.1.3.1 菌株活化
• 2.2.1.3.2 农杆菌侵染
• 2.2.1.3.3 洗菌
• 2.2.1.3.4 抗性愈伤组织的筛选与分化
• 2.2.1.3.5 炼苗
• 2.2.2 转基因植株的分子鉴定
• 2.2.2.1 转基因植株后代的抗性筛选
• 2.2.2.1.1 PHIMES-Ubi-IPA1转化明恢86（T1代）PPT抗性筛选
• 2.2.2.1.2 EHA-1300-IPA1转化明恢86（T2代）Hyg抗性筛选
• 2.2.2.2 PCR检测
• 2.2.2.2.1 CTAB法微量提取转基因水稻总DNA
• 2.2.2.2.2 标记基因Hyg/Bar的PCR分析
• 2.2.2.3 RT-PCR检测
• 2.2.2.3.1 水稻组织（根、茎、叶）总RNA的提取
• 2.2.2.3.2 RT-PCR
• 2.2.2.4 Southern blotting检测
• 2.2.2.4.1 配制Southern杂交专用试剂
• 2.2.2.4.2 Southern blotting杂交
• 2.2.3 荧光定量PCR分析
• 2.2.3.1 IPA1基因在籼稻明恢86组织表达特异性分析
• 2.2.3.1.1 水稻幼苗的培养
• 2.2.3.1.2 幼苗的根、茎、叶RNA的提取
• 2.2.3.1.3 引物设计
• 2.2.3.2 荧光定量PCR反应
• 2.2.3.3 荧光定量PCR数据处理
• 2.2.4 PHIMES-Ubi-IPA1转化明恢86（T1代）转基因植株生理学指标测定
• 2.2.4.1 株高测定
• 2.2.4.2 分蘖数测定
• 2.2.4.3 节间长度测定
• 2.2.4.4 叶绿素含量测定
• 2.2.4.5 茎秆横切面电镜扫描
• 2.2.4.6 茎秆化学成分的测定
• 2.2.4.6.1 细胞壁组分含量的测定
• 2.2.4.6.2 钾元素含量测定
• 2.2.4.6.3 硅含量的测定
• 第三章. 实验结果与分析
• 3.1 研究光照条件对水稻愈伤组织诱导的影响
• 3.2 IPA1基因的遗传转化
• 3.3 转基因植株的PCR检测
• 3.3.1 PHIMES-Ubi-IPA1转化明恢86（T0代）PCR检测
• 3.3.2 转基因植株中IPA1基因的RT-PCR分析
• 3.3.3 Southern blot杂交分析
• 3.4 转基因植株后代的抗性筛选结果
• 3.4.1 PHIMES-Ubi-IPAl转化明恢86（T1代）PPT抗性筛选结果
• 3.4.2 EHA-1300-IPA1转化明恢86（T2代）Hyg抗性筛选结果
• 3.5 Real-time PCR
• 3.5.1 IPA1基因在籼稻明恢86的组织表达特异性分析
• 3.6 转基因植株生理学指标测定
• 3.6.1 转基因植株株高和分蘖数的测定
• 3.6.3 转基因植株节间长度的测定
• 3.6.4 转基因植株叶绿素含量的测定
• 3.6.5 茎秆横切面电镜扫描
• 3.6.6 茎秆化学成分的测定
• 3.6.6.1 细胞壁组分含量的测定
• 3.6.6.2 钾元素含量测定
• 3.6.6.3 硅元素含量测定
• 第四章 讨论
• 4.1 提高水稻抗倒性的策略
• 4.1.1 材料的选择
• 4.1.2 栽培条件和措施对水稻倒伏的影响
• 4.1.2.1 土壤环境
• 4.1.2.2 栽培密度
• 4.1.2.3 肥水管理
• 4.1.2.4 病虫害防治
• 4.2 分子标记辅助育种技术的应用
• 4.3 工作的延续性
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢