论文摘要
钒溴过氧化物酶(Vanadium bromoperoxidase, V-BPO)是海藻中含量比较丰富的一类卤素过氧化物酶。V-BPO具有良好的热稳定性,有机溶剂耐受性,能够催化多种反应,如烯烃的环氧化、溴化反应,有机硫化物的氧化反应以及氨基酸氧化反应等,具有很好的工业应用价值。本文利用超滤膜从珊瑚藻中分离纯化V-BPO,对其酶学性质进行考察,并对V-BPO在两相酶膜反应器中发生的催化反应进行了研究。本文建立了一种利用超滤法分离纯化V-BPO的简便、高效新方法。利用聚偏氟乙烯超滤膜对珊瑚藻中的钒溴过氧化物酶(EC 1.11.1.18,分子量740 kDa)进行分离纯化。首先,向粗酶液中加入原钒酸钠使酶液中VO43-终浓度为1 mmol/L,经过热沉淀,然后用超滤膜进行超滤纯化,并对膜的截留分子量、操作压力、起始蛋白浓度、搅拌速率、pH值、离子强度等条件进行了优化。分离纯化后得到酶活回收率为96%,纯化倍数为21倍,比活力为212 U/mg的钒溴过氧化物酶,为来自商品(Sigma公司)提供来自珊瑚藻的V-BPO(比活力=100 U/mg)比活力的2.1倍。本方法具有收率高,步骤简单等优点。对分离纯化后的V-BPO酶学性质进行研究。该酶最适pH为6.0,亚基分子量为66 kDa。动力学研究表明,在室温(25℃),pH=6.0下,MCD,KBr,H2O2的Km值分别为3.74μmol/L,0.119 mmol/L,0.016 mmol/L。具有良好的H2O2耐受性,同时,钒离子和钙离子可以提高酶的活性和热稳定性。研究了纯化后的V-BPO在两相酶膜反应器中催化氧化环己烯反应体系的特征。以膜反应器代替传统的“一锅法”反应器,分别从固定化方法,膜孔径,反应温度,载酶量,底物浓度和重复使用性等方面进行研究,在最佳催化反应条件下获得环氧环己烷最终浓度为19.87 mmol/L。此反应体系避免了传统的“一锅法”多相反应体系给后继的产物分离带来的困难;实现了有机相和水相的自动分离,简化了工艺过程,为V-BPO在两相酶膜反应器中的初步应用提供一些参考。
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中文摘要Abstract引言第一章 文献综述1.1 卤素过氧化物酶1.1.1 卤素过氧化物酶概述1.1.2 钒溴过氧化物酶1.1.2.1 钒溴过氧化物酶的分布1.1.2.2 钒溴过氧化物酶的结构1.1.2.3 钒溴过氧化物酶的性质1.1.2.4 钒溴过氧化物酶的分离纯化研究进展1.1.2.5 钒溴过氧化物酶催化化学反应研究进展1.1.3 膜分离纯化蛋白的研究进展1.2 酶的膜固定化方法1.2.1 传统的酶膜固定化方法1.2.2 新型的酶膜固定化方法1.3 酶膜反应器1.3.1 酶膜反应器概述1.3.2 酶膜反应器的原理1.3.3 酶膜反应器的特点1.3.4 酶膜反应器的分类和应用1.4 论文工作的背景、意义和主要研究内容1.4.1 背景和意义1.4.2 主要研究内容参考文献第二章 钒溴过氧化物酶的分离纯化研究2.1 引言2.2 实验材料2.2.1 珊瑚藻2.2.2 聚偏氟乙烯超滤膜2.2.3 试剂2.2.4 主要仪器设备2.3 实验方法2.3.1 粗酶液的制备2.3.2 热沉淀2.3.3 超滤膜纯化2.3.4 酶活性测定2.3.5 蛋白含量测定2.3.6 SDS-PAGE 电泳2.4 结果与讨论2.4.1 超滤膜的选择2.4.2 搅拌速率的影响2.4.3 起始蛋白浓度的影响2.4.4 操作压力的影响2.4.5 溶液PH 的影响2.4.6 离子强度的影响2.4.7 SDS-PAGE 的影响2.4.8 优化条件下各步骤纯化效果2.4.9 最佳条件下超滤结果与文献方法比较2.5 小结参考文献第三章 钒溴过氧化物酶的性质研究3.1 引言3.2 实验材料3.2.1 试剂3.2.2 主要仪器设备3.3 实验方法3.3.1 酶活性测定3.3.2 最适PH 值3.3.3 对PH 的耐受性3.3.4 对温度的耐受性3.3.5 酶反应动力学3.3.6 抑制剂对酶活的影响3.3.7 对不同浓度的双氧水的耐受性3.3.8 亚基分子量的确定3.4 结果与讨论3.4.1 最适PH 值的确定3.4.2 对PH 的耐受性3.4.3 对温度的耐受性3.4.4 不同底物KM 值的测定3.4.5 抑制剂对酶活的影响2O2 的耐受性'>3.4.6 对H2O2的耐受性3.4.7 SDS-PAGE 凝胶电泳3.5 小结参考文献第四章 两相酶膜反应器制备环氧环己烷的研究4.1 引言4.2 实验材料4.2.1 试剂4.2.2 主要仪器设备4.3 实验方法4.3.1 V-BPO 的膜固定化4.3.2 V-BPO 催化环己烯环氧化4.3.3 产物定量分析4.4 结果与讨论4.4.1 V-BPO 的膜固定化4.4.1.1 内标物标准曲线的制作4.4.1.2 不同方法固定酶对载酶量的影响4.4.1.3 不同孔径超滤膜的选择4.4.2 溴过氧化物酶催化环己烯环氧化4.4.2.1 流动方式不同对反应速率的影响4.4.2.2 两相流速对反应速率的影响4.4.2.3 温度对反应速率的影响4.4.2.4 酶量对反应速率的影响4.4.2.5 底物浓度对反应速率的影响4.4.2.6 固定酶膜与游离酶的反应时间比较4.5 小结参考文献第五章 结论与展望在学研究成果致谢
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