溴过氧化物酶的提取及酶膜反应器研究

溴过氧化物酶的提取及酶膜反应器研究

论文摘要

钒溴过氧化物酶(Vanadium bromoperoxidase, V-BPO)是海藻中含量比较丰富的一类卤素过氧化物酶。V-BPO具有良好的热稳定性,有机溶剂耐受性,能够催化多种反应,如烯烃的环氧化、溴化反应,有机硫化物的氧化反应以及氨基酸氧化反应等,具有很好的工业应用价值。本文利用超滤膜从珊瑚藻中分离纯化V-BPO,对其酶学性质进行考察,并对V-BPO在两相酶膜反应器中发生的催化反应进行了研究。本文建立了一种利用超滤法分离纯化V-BPO的简便、高效新方法。利用聚偏氟乙烯超滤膜对珊瑚藻中的钒溴过氧化物酶(EC 1.11.1.18,分子量740 kDa)进行分离纯化。首先,向粗酶液中加入原钒酸钠使酶液中VO43-终浓度为1 mmol/L,经过热沉淀,然后用超滤膜进行超滤纯化,并对膜的截留分子量、操作压力、起始蛋白浓度、搅拌速率、pH值、离子强度等条件进行了优化。分离纯化后得到酶活回收率为96%,纯化倍数为21倍,比活力为212 U/mg的钒溴过氧化物酶,为来自商品(Sigma公司)提供来自珊瑚藻的V-BPO(比活力=100 U/mg)比活力的2.1倍。本方法具有收率高,步骤简单等优点。对分离纯化后的V-BPO酶学性质进行研究。该酶最适pH为6.0,亚基分子量为66 kDa。动力学研究表明,在室温(25℃),pH=6.0下,MCD,KBr,H2O2的Km值分别为3.74μmol/L,0.119 mmol/L,0.016 mmol/L。具有良好的H2O2耐受性,同时,钒离子和钙离子可以提高酶的活性和热稳定性。研究了纯化后的V-BPO在两相酶膜反应器中催化氧化环己烯反应体系的特征。以膜反应器代替传统的“一锅法”反应器,分别从固定化方法,膜孔径,反应温度,载酶量,底物浓度和重复使用性等方面进行研究,在最佳催化反应条件下获得环氧环己烷最终浓度为19.87 mmol/L。此反应体系避免了传统的“一锅法”多相反应体系给后继的产物分离带来的困难;实现了有机相和水相的自动分离,简化了工艺过程,为V-BPO在两相酶膜反应器中的初步应用提供一些参考。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 卤素过氧化物酶
  • 1.1.1 卤素过氧化物酶概述
  • 1.1.2 钒溴过氧化物酶
  • 1.1.2.1 钒溴过氧化物酶的分布
  • 1.1.2.2 钒溴过氧化物酶的结构
  • 1.1.2.3 钒溴过氧化物酶的性质
  • 1.1.2.4 钒溴过氧化物酶的分离纯化研究进展
  • 1.1.2.5 钒溴过氧化物酶催化化学反应研究进展
  • 1.1.3 膜分离纯化蛋白的研究进展
  • 1.2 酶的膜固定化方法
  • 1.2.1 传统的酶膜固定化方法
  • 1.2.2 新型的酶膜固定化方法
  • 1.3 酶膜反应器
  • 1.3.1 酶膜反应器概述
  • 1.3.2 酶膜反应器的原理
  • 1.3.3 酶膜反应器的特点
  • 1.3.4 酶膜反应器的分类和应用
  • 1.4 论文工作的背景、意义和主要研究内容
  • 1.4.1 背景和意义
  • 1.4.2 主要研究内容
  • 参考文献
  • 第二章 钒溴过氧化物酶的分离纯化研究
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 珊瑚藻
  • 2.2.2 聚偏氟乙烯超滤膜
  • 2.2.3 试剂
  • 2.2.4 主要仪器设备
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 粗酶液的制备
  • 2.3.2 热沉淀
  • 2.3.3 超滤膜纯化
  • 2.3.4 酶活性测定
  • 2.3.5 蛋白含量测定
  • 2.3.6 SDS-PAGE 电泳
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 超滤膜的选择
  • 2.4.2 搅拌速率的影响
  • 2.4.3 起始蛋白浓度的影响
  • 2.4.4 操作压力的影响
  • 2.4.5 溶液PH 的影响
  • 2.4.6 离子强度的影响
  • 2.4.7 SDS-PAGE 的影响
  • 2.4.8 优化条件下各步骤纯化效果
  • 2.4.9 最佳条件下超滤结果与文献方法比较
  • 2.5 小结
  • 参考文献
  • 第三章 钒溴过氧化物酶的性质研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 试剂
  • 3.2.2 主要仪器设备
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 酶活性测定
  • 3.3.2 最适PH 值
  • 3.3.3 对PH 的耐受性
  • 3.3.4 对温度的耐受性
  • 3.3.5 酶反应动力学
  • 3.3.6 抑制剂对酶活的影响
  • 3.3.7 对不同浓度的双氧水的耐受性
  • 3.3.8 亚基分子量的确定
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 最适PH 值的确定
  • 3.4.2 对PH 的耐受性
  • 3.4.3 对温度的耐受性
  • 3.4.4 不同底物KM 值的测定
  • 3.4.5 抑制剂对酶活的影响
  • 2O2 的耐受性'>3.4.6 对H2O2的耐受性
  • 3.4.7 SDS-PAGE 凝胶电泳
  • 3.5 小结
  • 参考文献
  • 第四章 两相酶膜反应器制备环氧环己烷的研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 试剂
  • 4.2.2 主要仪器设备
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 V-BPO 的膜固定化
  • 4.3.2 V-BPO 催化环己烯环氧化
  • 4.3.3 产物定量分析
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 V-BPO 的膜固定化
  • 4.4.1.1 内标物标准曲线的制作
  • 4.4.1.2 不同方法固定酶对载酶量的影响
  • 4.4.1.3 不同孔径超滤膜的选择
  • 4.4.2 溴过氧化物酶催化环己烯环氧化
  • 4.4.2.1 流动方式不同对反应速率的影响
  • 4.4.2.2 两相流速对反应速率的影响
  • 4.4.2.3 温度对反应速率的影响
  • 4.4.2.4 酶量对反应速率的影响
  • 4.4.2.5 底物浓度对反应速率的影响
  • 4.4.2.6 固定酶膜与游离酶的反应时间比较
  • 4.5 小结
  • 参考文献
  • 第五章 结论与展望
  • 在学研究成果
  • 致谢
  • 相关论文文献

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