猪肉嫩度性状评价体系研究及嫩度相关新基因的克隆、时空表达谱分析

论文摘要

本研究采集18头六月龄DLY商品猪的背最长肌样品,通过24、72、144小时三种不同时间嫩化处理得到54份嫩度性状表现有差异的样品。利用Warner-Bratzler剪切力测定、质构剖面分析（TPA）和感官评定,分析了各样品的质构性状,并分析了仪器测定与感官测定数据间的线性关系。Warner-Bratzler剪切力测定中得到的最大剪切力、W-B硬度和平均剪切力与感官硬度、弹性、多汁性间均存在显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）的相关性,其中最强的相关关系表现在最大剪切力与感官硬度间（r=0.69385,P＜.0001）;TPA分析数据与感官测定指标间的相关程度较弱,最强的相关关系表现在感官硬度与TPA硬度间（r=0.46075,P=0.0047）。进一步采用主成分-逐步回归法,以仪器测定指标为自变量,感官评定指标为依变量进行回归分析,分别得到具有统计意义的感官硬度、感官弹性和多汁性的预测方程,其中对感官硬度的预测效果较好,方程决定系数达到0.6146;而对感官弹性和多汁性的预测效果较差,方程决定系数为0.3977和0.4234。采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪组织蛋白酶B（CTSB）基因的cDNA序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪CTSB基因开放阅读框（ORF）全长1008bp,编码335个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、小家鼠、牛的CTSB基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为81%、79%、91%。利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点。利用直接测序的方法,分别在第六和第七外显子内发现两处未造成编码氨基酸改变的T-C同义突变位点,另外还采用PCR-SSCP方法,在237头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SSCP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型。FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.79 kg和24.06 kg.s,极显著地高于EE和EF基因型个体（P＜0.01）,平均剪切力为5.23 kg,显著地高于EF基因型个体（P＜0.05）。另外发现CTSB基因的一种转录变异体CTSB2,在5’非编码区内比野生型CTSB mRNA多出一段140 bp的插入序列,推测可能是由外显子可变剪切造成的。Real-Time PCR结果表明CTSB基因mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种因素影响。表达量最高的组织为肾脏和肝脏,而在心肌和骨骼肌中低丰度表达,并且在三处不同部位的骨骼肌间无显著表达量差异。CTSB基因mRNA表达量在0～5月龄长白猪和梅山猪背最长肌中表现出先升高后降低的变化趋势,梅山猪峰值出现较早,并在4月龄后再次出现急剧上升趋势。而在藏猪背最长肌中则表现出持续降低的变化趋势,且该基因表达量极显著地高于其他两个品种。同样采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪肉嫩度性状候选基因—半胱氨酸蛋白酶抑制素B（Cystatin B,CTSB）基因序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪Cystatin B基因ORF全长297bp,编码98个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的Cystatin B基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为81%、85%、89%,推测的氨基酸序列同源性为83%、76%、85%。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白与人、鼠Cystatin B类似,具有stefin类蛋白酶抑制剂的典型空间结构,包括5条平行的β-sheet和负责与被抑制酶结合的楔形边缘。另外还采用PCR-RFLP方法,分析了237头个体CSTB基因第二内含子内PvuⅡ酶切位点的多态性,检测到了AA、AB和BB三种基因型,关联性分析表明AA基因型个体的各项嫩度指标均极显著低于另两种基因型的个体（P＜0.01）,最大剪切力为5.76kg、硬度值为20.15kg.s、平均剪切力为3.66kg。Real-Time PCR试验结果表明CSTB基因mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种因素影响.表达量最高的组织为肾脏和肠系膜淋巴结,而在心肌和骨骼肌中低丰度表达,股四头肌组织表达量极显著高于眼肌。CSTB基因mRNA表达量在0～5月龄梅山和2～12月龄藏猪表现出生后初期较高,随后逐渐降低的表达模式:而外种猪长白猪的表达模式则为出生后表达量急剧升高,2月龄达到峰值,随后逐渐降低。CSTB和CTSB两基因的mRNA表达量表现出较高的正相关,但相关程度受到品种因素影响。

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摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 研究背景

1.1.1 肉类品质决定因素——嫩度

1.1.2 肉制品嫩度评价中存在的问题

1.1.3 尚未明确的嫩度性状遗传机制

1.2 本研究的目标和内容

参考文献

第二章文献综述

2.1 肉类嫩度及其影响因素

2.1.1 肌纤维的结构、性质和种类

2.1.2 结缔组织的分布、密度和性质

2.1.3 肌内脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量

2.1.4 肌肉内源蛋白酶

2.1.5 影响嫩度的分子遗传标记

2.2 肉类嫩度分析研究进展

2.2.1 肉类嫩度与质构

2.2.2 Warner-Braztler剪切力测试的广泛应用

2.2.3 质构剖面分析（TPA）测试的引入

2.2.4 其他测试方法

2.2.5 感官评定

2.2.6 感官评定与仪器测试结果的相关性研究

2.3 宰后肌肉蛋白水解因子——组织蛋白酶B

2.3.1 组织蛋白酶概述

2.3.2 组织蛋白酶B的蛋白及基因结构

2.3.3 组织蛋白酶B的合成、运输与活化

2.3.4 组织蛋白酶B酶活性的调节

2.3.5 组织蛋白酶B的生理功能

2.4 组织蛋白酶特异性抑制因子——Cystatin B

2.4.1 Cystatin家族概述

2.4.2 Cystatin B的蛋白及基因结构

2.4.3 Cystatin B的生理功能

参考文献

第三章猪肉嫩度评价体系研究

3.1 技术路线

3.2 实验方法

3.2.1 实验材料及样品采集

3.2.2 前处理

3.2.3 Warner-Bratzler剪切力测定

3.2.4 TPA测定

3.2.5 感官测定

3.2.6 数据分析

3.3 结果

3.3.1 Warner-Bratzler剪切力测定结果

3.3.2 TPA测定结果

3.3.3 质构分析与感官测定数据前处理

3.3.4 仪器测定指标与感官评定测定数据间的相关性分析

3.3.5 仪器测定指标间多重共线性的诊断

3.3.6 数据标准化

3.3.7 主成分分析

3.3.8 主成分回归分析

3.4 讨论

3.4.1 前处理

3.4.2 仪器质构分析

3.4.3 感官评价

3.4.4 仪器测定指标与感官评定测定数据间的相关性

3.4.5 质构分析指标的多重共线性问题

3.4.6 主成分的取舍问题

3.4.7 主成分回归

3.4.8 回归方程预测效率

参考文献

第四章猪Cathepsin B基因分子克隆、表达谱及遗传多态性分析

4.1 技术路线

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 实验动物

4.2.2 实验主要仪器

4.2.3 主要试剂

4.2.4 常用试剂的配制

4.3 实验方法

4.3.1 嫩度性状测定

4.3.2 CTSB基因克隆及序列分析

4.3.3 CTSB基因多态性分析

4.3.4 CTSB mRNA表达量定量分析

4.3.5 数据分析

4.4 结果

4.4.1 总RNA和总DNA抽提结果

4.4.2 克隆序列分析结果

4.4.3 多态性分析结果

4.4.4 CTSB mRNA表达量定量分析结果

4.5 讨论

4.5.1 电子克隆及引物设计

4.5.2 CTSB核酸及蛋白结构

4.5.3 CTSB可变剪切

4.5.4 CTSB多态性以及遗传效应

4.5.5 CTSB基因mRNA表达谱

参考文献

第五章猪Cystatin B基因cDNA克隆、遗传多态性及表达谱分析

5.1 技术路线

5.2 实验材料与仪器

5.2.1 实验动物

5.2.2 实验主要仪器

5.2.3 主要试剂

5.2.4 常用试剂的配制

5.3 实验方法

5.3.1 嫩度性状测定

5.3.2 CSTB基因克隆及序列分析

5.3.3 CSTB基因多态性分析

5.3.4 CSTB mRNA表达量定量分析

5.3.5 数据分析

5.4 结果

5.4.1 总RNA和总DNA抽提结果

5.4.2 克隆序列分析结果

5.4.3 多态性分析结果

5.4.4 CSTB mRNA表达量定量分析结果

5.5 讨论

5.5.1 CSTB序列及结构

5.5.2 CSTB多态性以及遗传效应

5.5.3 CSTB基因mRNA表达谱

参考文献

第六章结论及展望

6.1 研究总结

5.1.1 猪肉嫩度评价体系方面

5.1.2 猪Cathepsin B基因分子克隆、表达谱及遗传多态性分析方面

5.1.3 猪Cystatin B基因cDNA克隆、遗传多态性及表达谱分析方面

6.2 研究展望

致谢

附录一:攻博期间公开发表的论文

附录二:肉类感官测定记录表

猪肉嫩度性状评价体系研究及嫩度相关新基因的克隆、时空表达谱分析

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