论文摘要
胃肠道肿瘤是临床上最常见恶性肿瘤之一,常规的治疗手段,包括手术、化疗和放疗,均未能有效提高病人尤其晚期病人的治愈率和生存率。近年,在肿瘤免疫学研究领域,树突状细胞（DCs）为基础的免疫治疗被认为是诸多肿瘤疫苗策略中最具希望者之一。DCs作为效力最强的抗原呈递细胞（APCs）,具有高效摄取、加工、提呈肿瘤相关抗原（TAA）,并激活初始免疫反应的独特功能。然而,许多研究表明肿瘤具有免疫逃逸的生物学特性,在肿瘤微环境中未成熟DCs因分化成熟受限而积聚增加,成熟的功能性DCs数量下降,诱导T淋巴细胞失能或调节性T细胞（Tregs）产生,最终导致抗肿瘤免疫抑制形成。己有大量的人和动物实验证明,应用外周血单核细胞来源的DCs在体外诱导活化,可使其功能从肿瘤微环境下的免疫抑制状态完全恢复,并负载肿瘤抗原制备为DCs疫苗回输体内,能够观察到TAA-特异性T细胞抗肿瘤免疫反应,并在部分病人获得了肿瘤部分消退的临床效果。尽管这些研究结果令人鼓舞,但迄今为止,DCs疫苗在癌症患者体内所诱导的免疫反应尚未足以达到非常突出的治愈性的临床治疗作用。所以,DCs疫苗的效力尚需进一步提高,以期成功应用于临床。增强DCs疫苗抗肿瘤免疫效应的策略包括:①调整DCs的成熟过程;②增强CD4+ T细胞免疫;③阻断调节性免疫抑制途径;④靶向肿瘤形成中的有效抗原靶点。肿瘤的成功治疗需要多种方法结合,多个步骤依次进行,DCs疫苗与免疫佐剂类活性物联合应用可以解决其免疫效力不足的问题。实验表明,辅以CD40L、IL-12、IL-2、热休克蛋白Hsp70等活性因子治疗,可增强并延续DCs诱导的CD4+Th1细胞反应和特异性CTLs杀伤作用,但临床应用存在毒副作用较大的问题。胸腺肽α1（Tα1）是一种功能强大的免疫调节剂,已应用于临床多年,毒副作用小,其可促进T淋巴细胞分化成熟和增殖,增加IL-2、IL-6、IFN-γ分泌,且研究报道对小鼠骨髓和正常人外周血来源DCs分化成熟有促进作用,可刺激DCs分泌IL-12和增强Th1反应。DCs疫苗制备大多采用负载肿瘤细胞裂解物或总mRNA等肿瘤细胞全抗原的治疗方案。此方案的优势在于疫苗有可能诱导激活多克隆T细胞扩增和多肿瘤抗原特异性的CTLs,而且应用病人自体全肿瘤抗原无需进行HLA配型,疫苗的安全性也已得到一定验证,临床试验很少观察到自身免疫的发生。构建适宜的动物模型是实验研究的重要组成部分,本研究中经尾静脉注射人T淋巴细胞,借助先天性T细胞免疫功能缺陷的荷瘤裸鼠,构建人源化T细胞免疫动物模型,通过体内、外实验,对Tα1促进DCs分化成熟以及增强DCs疫苗的抗肿瘤效应进行客观评估,进一步探讨Tα1新的免疫作用途径和靶细胞,以期为开展临床DCs疫苗抗肿瘤免疫治疗提供一种有效的、具有免疫佐剂活性的辅助免疫因子。本研究共分以下四个方面:第一部分胃肠肿瘤患者外周血树突状细胞功能学及其与CD4+CD25+T细胞失衡相关性的研究目的:探讨胃肠肿瘤（GIC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）来源树突状细胞和CD4+CD25+T细胞（Tregs）的免疫功能状态、两者的相关性,以及与肿瘤临床病理分期和手术的关系。方法:收集早期胃肠癌（Ⅰ/Ⅱ期）患者术前、术后第7天、以及晚期癌（Ⅲ/Ⅳ期）患者外周血,以健康成人外周血为对照。提取PBMCs,流式细胞术（FACS）分别检测Tregs占CD4+T细胞的比例。PBMCs经贴壁法分离提取DCs,经rhGM-CSF、rhIL-4体外扩增培养至第5天,获得未成熟DCs （imDCs）,FACS检测表型;imDCs经rhTNF-α诱导培养至第7天,获得成熟DCs （mDCs）,MTT法和ELISA法分别检测mDCs与自体T细胞混合培养时mDCs刺激T细胞增殖能力以及上清液中IFN-γ的含量。结果:晚期胃肠癌患者imDCs表型HLA-DR、CD80及CD86均显著低于健康成人和早期癌患者（P<0.01）;早期胃肠癌术后第7天患者imDCs表型HLA-DR及CD86表达显著低于健康成人（P<0.05）。晚期胃肠癌患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力与健康成人相比均有所减弱（P=0.073,P= 0.182）,CD4+T细胞中Tregs的比例显著低于健康成人和早期癌患者（P<0.001）;早期胃肠癌患者术后Tregs比例略低于术前（P=0.148）及健康成人（P=0.068）。HLA-DR、CD86表达与Tregs比例呈负相关性。结论:胃肠肿瘤患者尤其晚期和术后患者外周血DCs功能失调以及Tregs失衡可能和机体抗肿瘤细胞免疫耐受密切相关。第二部分胸腺肽α1对胃肠肿瘤患者外周血树突状细胞功能和CD4+CD25+ T细胞失衡影响的实验研究目的:探讨Tα1治疗前、后GIC患者外周血PBMCs来源DCs的免疫功能状态及CD4+CD25+ T细胞失衡的变化。方法:早期胃肠癌（Ⅰ/Ⅱ期）手术患者于术后第16天连续皮下注射Tα1,1.6mg/次/日,于术日和术后第7天晨分别采集外周静脉血;晚期患者入院后第49天连续皮下注射Tα1,1.6mg/次/日,并于入院后第4、10天晨分别采集外周静脉血。提取PBMCs,FACS分别检测Tregs占CD4+T细胞的比例。PBMCs经贴壁法分离提取DCs,经rhGM-CSF、rhIL-4体外扩增培养至第5天,获得未成熟imDCs,FACS检测表型;imDCs经rhTNF-α诱导培养至第7天,获得mDCs,MTT法和ELISA法分别检测mDCs与自体T细胞混合培养时mDCs刺激T细胞增殖能力以及上清液中IFN-γ的含量。结果:晚期胃肠癌患者imDCs表型HLA-DR、CD80及CD86治疗后均显著高于治疗前（P<0.01）;早期胃肠癌术后第7天患者imDCs表型HLA-DR及CD86治疗后均显著高于治疗前（P<0.05）。晚期胃肠癌患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力治疗后与治疗前相比均显著增强（P<0.01）,CD4+T细胞中Tregs的比例治疗后略低于治疗前（P=0.065）;早期胃肠癌术后第7天患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力治疗后与治疗前和未治疗组相比均显著增强（P<0.05）,Tregs比例较治疗前及治疗组基本无变化。结论:Tα1治疗胃肠肿瘤患者尤其晚期和术后患者外周血可以改善DCs免疫功能。第三部分胸腺肽α1对负载结肠癌肿瘤抗原的树突状细胞功能影响的体外实验研究目的:观察Tα1对结肠癌细胞裂解物（TuLy）负载DCs（LyDCs）的表型和功能的影响。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导培养imDCs,并负载TuLy后制备LyDCs疫苗。Tα1体外刺激imDCs、LyDCs,FACS检测DCs表型变化;ELISA法检测LyDCs与自体T细胞共培养时,Tα1对LyDCs分泌IL-12以及活化T细胞分泌IFN-γ水平的影响;MTT法检测LyDCs经Tα1刺激后所诱导的细胞毒活性的变化。结果:Tα1刺激后的imDCs、LyDCs表型HLA-DR、CD80、CD86、CD83均上调（P﹤0.01）;Tα1刺激组上清液中细胞因子IL-12和IFN-γ的水平较未刺激组增加（P﹤0.05,P﹤0.01）;LyDCs经Tα1刺激后诱导的CTLs细胞毒活性较未经Tα1刺激组增强（P﹤0.01）。结论:Tα1可促进DCs分化成熟,并能增强LyDCs诱导的CD4+Th1细胞反应和CTLs的杀伤效应。Tα1与LyDCs疫苗联合应用时具有较好的免疫佐剂活性。第四部分胸腺肽α1联合树突状细胞疫苗对人源化免疫重建裸鼠结肠癌免疫抑制效应的体内实验研究目的:观察Tα1联合结肠癌细胞裂解物致敏树突状细胞LyDCs对人源化免疫重建裸鼠结肠癌的免疫治疗效应。方法:常规未成熟DCs负载结肠癌细胞裂解物制备LyDCs疫苗。HT-29结肠癌裸鼠成瘤后,经尾静脉注射人外周血T淋巴细胞6×106/只,2天后,流式细胞仪检测裸鼠人源性CD4+、CD8+T细胞;将人源化免疫重建裸鼠随机分为3组,分别用LyDCs+Tα1、LyDCs和生理盐水皮下免疫注射治疗;治疗后7天,体外观察各组裸鼠脾脏淋巴细胞的肿瘤杀伤作用及IFN-γ、IL-4分泌水平,实验结束时,观察LyDCs联合Tα1对结肠癌裸鼠的体内抑瘤作用。结果:免疫重建裸鼠均检测到人源性CD4+、CD8+T细胞;LyDCs+Tα1组裸鼠脾脏T淋巴细胞的肿瘤杀伤作用与LyDCs组比较差异显著（P﹤0.01）,LyDCs+Tα1组T细胞的IFN-γ分泌水平与LyDCs组比较差异显著（P﹤0.01）;接种HT-29细胞58天后,LyDCs+Tα1组、LyDCs组抑瘤率分别为60.41%、37.20%,两组之间抑瘤效应比较差异显著（P﹤0.01）,两组的抑瘤效应与对照组比较分别（P﹤0.01）。结论:Tα1能增强LyDCs诱导的CD4+Th1细胞反应和CTLs杀伤效应,对DCs疫苗的抗肿瘤免疫治疗功效具有明显的放大作用。
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