桑叶中1-脱氧野尻霉素的分离纯化技术研究

论文摘要

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin,DNJ）是一种天然糖的结构类似物。现代药理研究表明,DNJ是一种高效的α-糖苷酶抑制剂,具有很好的降血糖活性,应用前景广阔。目前,DNJ的主要获得途径有天然来源和化学合成,但现有的化学合成方法存在过程复杂、条件苛刻、产率低等弊端。因此,从天然产物中获得高纯度DNJ成为当今研究的热点。现代研究发现,多种植物和微生物中含有DNJ,但其中以桑叶中含量最高。此外,家蚕一生食桑,其DNJ含量远高于桑叶,目前对家蚕体内DNJ含量变化规律的研究较少。本论文研究了不同季节桑叶和不同成长发育阶段家蚕及其副产物中DNJ含量的变化规律,并采用现代提取分离技术研究了桑叶中DNJ的提取纯化工艺。主要研究内容和结论如下:1、建立了DNJ的分析方法。研究了DNJ的TLC分析方法。采用硅胶G薄层板,正丙醇:醋酸:水（8:2:1）为展开剂,氯-联甲苯胺显色。此法简易灵敏,重现性好。建立了DNJ的HPLC分析方法。采用芴甲氧酰氯（FMOC-C1）柱前荧光衍生-高效液相色谱法分析测定了桑叶中DNJ含量,样品经0.05M盐酸提取,在pH8.5的硼酸盐缓冲液条件下FMOC-C1与DNJ反应生成荧光产物,然后用高效液相色谱-荧光检测器测定。流动相为乙腈-0.1%醋酸（50:50V/V）。线性范围为0.57～50.40μg/mL（相关系数R=0.9999）。实验测得桑叶中DNJ含量为0.24%。方法简便快速,灵敏准确,衍生产物稳定。研究了DNJ的GC分析方法。采用乙酰化衍生-气相色谱法分析测定了桑叶中DNJ含量,桑叶用50%甲醇溶液提取,经001×7树脂纯化后,用乙酸酐酰化,进行气相色谱分析。线性范围为40～200μg/mL（相关系数R=0.9992）。实验测得桑叶中DNJ平均含量为0.218%。该方法准确、可靠,重现性良好,也可用于DNJ的含量分析。2、采用芴甲氧酰氯（FMOC-C1）柱前荧光衍生-高效液相色谱法分析测定了不同季节桑叶中DNJ的含量。结果表明,3到6月桑叶中DNJ含量逐渐升高,7、8月份达到最高,分别为0.315%和0.313%,9月后又逐渐降低。初步揭示了桑叶中DNJ含量随季节变化的规律。3、测定了不同成长发育阶段家蚕及其副产物中DNJ的含量。随着家蚕幼虫生长,DNJ含量总体表现为先上升后下降的趋势,龄期发育阶段以3龄蚕体含量最高,达0.416%,随后逐渐减少,蚕蛹中DNJ含量显著低于幼虫,蚕蛾中DNJ含量更少,分别为0.017%和0.012%。蚕沙和蚕蜕中DNJ含量以一龄蚕最高,分别为0.688%和0.698%,随着家蚕幼虫的生长,其蚕沙和蚕蜕中DNJ的含量均减少,蚕蜕减少幅度较大,四龄蚕蜕中DNJ的含量仅为0.048%,蚕沙变化幅度较小,五龄蚕沙中DNJ的含量为0.343%。4、从工业应用角度出发,研究获得了桑叶中DNJ的简单可行的提取分离纯化工艺路线。最佳提取工艺为50%乙醇,12倍生药量,90℃回流提取2次,每次1h。采用国产的离子交换树脂对桑叶中DNJ提取物进行分离和纯化。研究了国产001×7阳离子交换树脂的静态吸附性能和动态吸附性能,该树脂对DNJ的吸附容量为13.1mg/g,解吸率为90.4%。获得其吸附等温线和吸附动力学曲线,并对所得吸附等温线进行了拟合,结果表明其符合Langmuir方程。测定了穿透曲线和解吸曲线,饱和吸附量达13.8mg/g,解吸率可达92.3%。两种树脂再生性能良好。最佳纯化工艺为:上样液浓度为1.28mg/mL,0.5mol/L氨水6倍柱体积（BV）洗脱,流速为1.5ml/min,再经201×4阴离子交换树脂纯化后可得到纯度大于50%的DNJ提取物。5、对所用树脂和纯化物进行有害物质残留量分析,结果表明001×7树脂和201×4树脂用3BV 95%乙醇处理后,树脂中的有机残留物基本洗净,经树脂纯化后的纯化物也未检出有机残留物。表明所采用的树脂预处理方法有效、可行,经处理后的树脂可用于DNJ的分离纯化。6、研究了DNJ单体的制备方法。采用D152弱酸性阳离子树脂对已纯化的DNJ提取物进一步精制,并经重结晶,获得DNJ单体,采用高效液相色谱检测其纯度,所得DNJ纯度大于95%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 1-脱氧野尻霉素的研究现状
• 1.1.1 1-脱氧野尻霉素的药理作用
• 1.1.2 1-脱氧野尻霉素的获得途径
• 1.2 本课题的立题背景和意义
• 1.3 主要研究内容
• 本章参考文献
• 第二章 1-脱氧野尻霉素分析方法的建立
• 2.1 定性分析
• 2.1.1 引言
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.4 结果与讨论
• 2.2 定量分析
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 柱前衍生化高效液相法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素
• 2.2.3 乙酰化衍生气相色谱法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素
• 2.3 本章小结
• 本章参考文献
• 第三章 蚕桑资源中1-脱氧野尻霉素含量的研究
• 3.1 不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素含量的研究
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 结果与讨论
• 3.2 不同生长期家蚕及其副产物中1-脱氧野尻霉素含量的研究
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 结果与讨论
• 3.3 本章小结
• 本章参考文献
• 第四章 桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取、分离与纯化
• 4.1 仪器与试剂
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验材料与试剂
• 4.2 桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取工艺研究
• 4.2.1 实验方法
• 4.2.2 结果与讨论
• 4.3 桑叶中1-脱氧野尻霉素的纯化工艺研究
• 4.3.1 树脂的选择
• 4.3.2 树脂的预处理
• 4.3.3 静态吸附实验
• 4.3.4 动态吸附实验
• 4.3.5 树脂再生性能考察
• 4.4 201×4阴离子树脂除杂、纯化1-脱氧野尻霉素
• 4.5 树脂残留量的研究
• 4.5.1 方法学考察
• 4.5.2 树脂中有机残留物的检测
• 4.5.3 桑叶DNJ纯化物中有机残留物的检测
• 4.6 本章小结
• 本章参考文献
• 第五章 1-脱氧野尻霉素单体的制备
• 5.1 仪器与试剂
• 5.1.1 仪器与设备
• 5.1.2 材料与试剂
• 5.2 桑叶中1-脱氧野尻霉素单体的制备
• 5.2.1 树脂的选择
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 结果与讨论
• 5.3 本章小结
• 本章参考文献
• 第六章 总结与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 工作展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文