论文摘要
背景和目的脑外伤、脑出血和脑梗塞等脑损伤是人类致残的主要原因,存在抢救存活后预后差,目前无特殊治疗方法。本研究通过三个阶段探讨磁标记羊膜间充质干细胞移植对大鼠海马齿状回组织再生的影响。1、羊膜组织来源的细胞通过细胞形态学观察、流式细胞仪检测、MTT法细胞活性检测和神经元样细胞分化等鉴定为间充质干细胞,为超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs）标记细胞的实验研究提供干细胞来源。2、采用SPIONs单次和多次标记法标记羊膜间充质干细胞,探讨SPIONs标记羊膜间充质干细胞的安全浓度,明确SPIONs安全浓度对羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响；通过磁共振检测SPIONs标记的干细胞在体外和体内的信号存在和改变,为羊膜间充质干细胞移植治疗相关疾病的活体示踪提供实践基础。3、SPIONs标记的羊膜间充质干细胞移植入缺血缺氧性脑损伤侧脑皮质,MRI示踪干细胞移植后在宿主脑内分布和迁移情况,实现活体的无创性和连续性动态监测；通过免疫组织化学染色检测海马齿状回组织的再生,探讨干细胞在组织再生中扮演的角色。材料和方法：1.羊膜间充质干细胞的原代培养和神经元样细胞分化酶消化和贴壁培养法获取羊膜组织中细胞,通过细胞形态学观察、流式细胞仪检测、MTT法细胞活性检测和神经元样细胞诱导分化等鉴定羊膜来源的间充质干细胞。P3代生长状态良好的羊膜间充质干细胞培养于细胞诱导培养基,诱导细胞分三组。在1,2,4和7天分别进行1、MTT法分析细胞诱导培养基的细胞毒性；2、流式细胞仪分析间充质干细胞膜表面特异性分子的改变；3、RT-PCR和免疫细胞化学染色探讨羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的潜能。2.SPIONs标记羊膜间充质干细胞在体内外细胞磁共振成像SPIONs的浓度分别是3.5,7,14, and 28μg/ml的细胞生长培养基（Cytokine Growth Medium, CGM）或细胞诱导培养基（CIM）应用于本研究。两种SPIONs标记法应用于本研究：1、单次SPIONs标记法：细胞培养首次（0 d）更换的培养基含SPIONs,此后1 d、2d和4d更换的培养基不含SPIONs;2、多次SPIONs标记法：细胞培养首次（0 d）更换的培养基含SPIONs,此后1d、2d和4d更换的培养基含SPIONs。根据和细胞培养基不同和SPIONs的标记方法不同分为六组：1、细胞生长培养基组；2、细胞生长培养基+单次SPIONs标记组；3、细胞生长培养基+多次SPIONs标记组；4、细胞诱导培养基组；5、细胞诱导培养基+单次SPIONs标记组；6、细胞诱导培养基+多次SPIONs标记组。细胞生长培养基（CGM）培养的细胞分别收获于1、2、4和7 d,各时间点获得细胞分为三组分别行MTT法、普鲁氏蓝染色和流式细胞仪检测；细胞诱导培养基（CIM）培养的细胞分别收获于1、2、4和7 d,各时间点获得细胞分为三组分别行MTT法、普鲁氏蓝染色、免疫细胞化学染色、RT-PCR和流式细胞仪检测；无SPIONs的细胞生长培养基组和细胞诱导培养基组作为对照组。羊膜间充质干细胞培育于SPIONs浓度分别为3.5μg/m、7μg/ml、14μg/ml和28μg/ml的细胞生长培养基,共同孵育1天后消化、离心,悬于1.5 ml 1%琼脂糖的Ependoff管,冷却固化,SIEMEMS 3.0 Trio TimⅠ-class MR扫描仪成像磁共振成像,完成SPIONs标记羊膜间充质干细胞体外细胞磁共振成像。Wistar大鼠分组：1、14μg/ml SPIONs标记的羊膜间充质干细胞动物移植组,2、14μg/ml SPIONs动物移植组。移植细胞制备14μg/ml SPIONs标记的羊膜间充质干细胞（1天）,1×106细胞混悬液5μl作为移植备用。细胞移植方法：健康Wistar大鼠腹腔麻醉,前卤前0.5 mm、旁开3.0 mm为中心钻孔径约为1 mm的孔,缓慢注射至左侧脑皮层（距离硬脑膜表面2mm）。对照组使用5μl 14μg/ml SPIONs的PBS液。移植后1天、1、4和7周行MRI检查。14μg/mlSPIONs动物移植组方法同细胞移植方法,完成SPIONs标记羊膜间充质干细胞体内细胞磁共振成像。3.羊膜间充质干细胞移植对脑缺血缺氧性大鼠海马组织再生的影响将7同龄新生大鼠共48只,随机分成6组,各组8只：A组（假手术组）：分离不结扎左侧颈总动脉；B组（模型制备组）：制备模型成功,不进行细胞移植；C组（模型制备+损伤侧PBS液移植组）：制备模型成功,移植5μl PBS液；D组（模型制备+损伤侧SPIONs液移植组）：制备模型成功,移植SPIONs5μl;E组（模型制备+损伤侧干细胞移植组）：制备模型成功,移植未经SPIONs标记的羊膜间充质干细胞5μl;F组（模型制备+损伤侧SPIONs标记干细胞移植组）：制备模型成功,移植未经SPIONs标记的羊膜间充质干细胞5μl；每组动物不同时间点（移植后1天、1周、4周和7周）分别进行MRI检查和脑组织海马组织GFAP的免疫组织化学染色。羊膜间充质干细胞悬液的准备、移植、MRI监测和免疫组织化学染色等方法雷同于前一阶段研究。结果1.羊膜组织经胰酶和胶原酶消化,获取的细胞悬液原代接种于培养瓶。原代P0培养24小时,少量细胞贴壁；48小时,贴壁细胞数量增多；培养72小时,贴壁细胞数量明显增多；培养7天,贴壁细胞基本铺满培养瓶底,接近50%～60%融合,贴壁细胞呈成纤维细胞样。P3-P10代细胞的生长曲线基本相同,P10代以后细胞活力衰减。羊膜间充质干细胞的流式细胞仪检测分析显示：原代培养的P3代细胞,培养于细胞生长培养基中其高表达膜表面分子CD29, CD44, CD90,CD105；阴性表达CD31,CD34, CD45和CD106。羊膜间充质干细胞培养于细胞诱导培养基。细胞形态改变显示：培养7天,50-70%的细胞呈类似神经元样细胞形态并且细胞的细长突起交织成网。流式细胞仪检测分析显示：7天时阴性表达CD29, CD44, CD90和CD105。RT-PCR检测分析显示：1天时Nestin表达,2天时表达减少；4天时表达明显减少；7天时无表达。1天时NSE无表达,2天时开始表达；4天时表达增加；7天表达明显增加。免疫细胞化学染色结果显示：诱导早期的细胞呈成纤维样改变,Nestin染色阳性；诱导后期的细胞呈单极或多极改变,NSE染色阳性,细胞突起明显,呈类似神经元样细胞形态；无GFAP染色细胞。2.不同SPIONs标记方法标记羊膜间充质干细胞,细胞爬片经普鲁氏蓝染色结果显示：各组细胞SPIONs标记率均为100%,胞质内存在数量不等的蓝染颗粒。MTT结果显示明确小于和等于14μg/mlSPIONs是标记羊膜间叫充质干细胞细胞活性大于80%。单次SPIONs标记法：同一时间的不同标记浓度,细胞胞质内蓝染颗粒,随标记浓度增加,铁颗粒呈簇状聚集分布成堆。同一标记浓度的不同时间,当SPIONs浓度小于和等于14μg/ml,细胞胞质内蓝染颗粒聚集,随标记浓度时间延长,散布较前减少；当SPIONs浓度大于14μg/ml细胞胞质内蓝染颗粒聚集前后无变化。多次SPIONs标记法：同一时间的不同标记浓度,细胞胞质内细小蓝染颗粒散布,随标记浓度增加,铁颗粒呈簇状聚集分布成堆。同-标记浓度的不同时间,当SPIONs理论标记浓度小于和等于14μg/ml,细胞胞质内蓝染颗粒聚集,随标记浓度次数增加和时间延长,呈聚集增加；当SPIONs浓度大于14μｇml细胞胞质内蓝染颗粒聚集前后无变化。单次SPIONs标记法：羊膜间充质干细胞培养于含14μg/ml SPIONs的CGM,7天羊膜间充质干细胞膜表面分子阳性表达CD29, CD44, CD90和CD105。羊膜间充质干细胞培养于含14μg/ml SPIONs的CIM,2天羊膜间充质干细胞膜表面分子明显低表达CD29,CD44, CD90和CD105。Ependoff管内SPIONs标记细胞信号强度随SPIONs标记浓度的增高在SWI序列图像依次降低,两者存在高度线性相关。14μg/ml SPIONs标记羊膜间充质干细胞直接移植入正常大鼠脑皮层后,移植1天后仍可在SWI序列图像显示为局限性极低信号,1周后低信号边缘模糊,至7周后此低信号仍可在SWI序列图像显示。对照组14μg/ml SPIONs的PBS液在移植1周时低信号消失。3.新生大鼠脑缺血缺氧模型各组动物SWI序列图像A组（假手术组）,B组（模型制备组）,c组（模型制备+损伤侧PBS液移植组）和E组（模型制备+损伤侧干细胞移植组）实验动物在移植后1天、1周、4周和7周各个时间点的MRI检查脑内均未见异常信号。D组（模型制备+损伤侧SPIONs液移植组）实验动物在移植后1天、1周、4周和7周各时间点的MRI检查均可在SWI显示缺血侧额颞顶皮层注射区域异常低信号区,且此异常高信号区域随时间推移逐渐缩小。F组（模型制备+损伤侧SPIONs标记干细胞移植组）实验动物在不同时间点的MRI检查,SWI序列图像显示缺血侧额颞顶皮层异常低信号区,随移植后时间目延长移植部位该低信号变化如下：移1天后,移植部位边界清晰的类圆形低信号；移植1周后,移植部位类圆形低信号边界略显模糊较1天时扩大；移植4周后,移植部位类圆形低信号有线状影沿胼胝体走行侧脑室；移植7周后,移植部位类圆形和线状影低信号边界较较前明显模糊。实验各组动物的海马结构GFAP（?）日性细胞密度顺序为齿状回>CA3区>CA2区>CAl区。CAl区血管密度由高到低依次为：腔隙分子层、辐射层、多形层和锥体层。CA1、CA2区层次性最明显,其中多形层毛细血管最丰富,锥体层最稀少：CA3区层次性稍差,齿状回毛细血管以分子层最密集,颗粒层最稀少。A组（假手术组）实验动物在不同时间点的海马组织GFAP阳性细胞呈高水平表达,且排列密集；各时间点微血管的密度和直径无统计学差异,P＞0.05。B组（模型制备组）、C组（模型制备+损伤侧PBS液移植组）和D组（模型制备+损伤侧SPIONs液移植组）比较,组间各相同时间点的微血管的密度和直径无统计学差异,P>0.05；各组实验动物在1天时海马组织GFAP阳性细胞呈低水平表达,且排列稀疏,1周较1天时表达增高仍呈低水平表达,有统计学差异,P<0.05；4周和7周同1周比较无无统计学差异,P＞0.05。E组（模型制备+损伤侧干细胞移植组）F组（模型制备+损伤侧SPIONs标记干细胞移植组）组间各相同时间点的微血管的密度和直径无统计学差异,P>0.05。各组实验动物在1天时海马组织GFAP阳性细胞呈低水平表达,且排列稀疏,1周较1天时表达增高仍呈中等水平表达,有统计学差异,P<0.05；4周同1周比较表达增高仍呈中等水平表达,有统计学差异,P<0.05。结论：1.酶消化贴壁培养法分离获取细胞,成功鉴定羊膜组织来源的间充质干细胞具有向神经元样细胞分化的能力。2.应用单次和多次SPIONs标记羊膜间充质干细胞,显示浓度14μg/ml SPIONs是羊膜间充质干细胞标记的安全浓度且能够在磁共振下显像于体内外,对其分化为神经元样细胞的生物学特性无影响。3. SPIONs标记羊膜间充质干细胞移植于动物模型后动态磁共振成像能够达到活体示踪目的。4.羊膜间充质干细胞移植治疗缺血缺氧性脑损伤,可以促进海马齿状回组织再生的激活。
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