论文摘要
柑橘全爪螨Panonychus citri（McGregor）属蛛形纲Arachnida、蜱螨目Acarina、叶螨科Tetranychidae、全爪螨属Panonychus。该螨是一种世界性害螨,寄主广泛,大多以刺吸方式为害叶片、嫩梢、果皮,尤以叶片受害最重,严重时导致落叶、落果,影响树势和产量。柑橘是中国南方最主要的水果之一,栽培品种多,出口数量大,是重要的经济作物。由于采取清耕法的集约化栽培,果园植物单一,加之单一依赖化学防治,用药不当,大量杀灭果园害螨天敌,破坏橘园的生态平衡,且该螨世代周期短,抗药性增加迅速,使柑橘全爪螨成为柑橘栽培中头等重要的害虫（螨）之一,是柑橘园常发性、灾害性的有害生物。柑橘全爪螨每年发生多代,一年有2个高峰期（春季至初夏和秋季）和2个低谷期（夏季和冬季）。已有研究表明,柑橘全爪螨适宜的温度范围为20-30℃,高于35℃不利于其生殖发育,40℃以上死亡率高。在中国柑橘主产区夏季气温常高达35℃以上,甚至40℃,冬季温度常低至0℃以下。极端温度的存在,必将对柑橘全爪螨造成热胁迫,柑橘全爪螨在长期的进化过程中形成了一系列响应机制应对热胁迫。热激蛋白（Heat shock proteins, Hsps）是当今生物适应逆境胁迫研究的热点,Hsps是广泛存在于原核细胞和真核细胞的蛋白质,亚致死热胁迫能够诱导生物体产生热激Hsps,它们能够提高生物的热忍耐力。此外热胁迫常会引起过氧化反应,有机体的抗氧化系统在应对氧化胁迫方面发挥着重要作用。物质和能量是守恒的,在有机体为应对胁迫而合成抗胁迫物质的同时,会减少其他有机物的合成,表现为缩短寿命、生殖力下降等,导致种群数量的变化。本学位论文以柑橘全爪螨为研究对象,瞄准生物适应逆境胁迫的机制这一国际研究热点,在生物学特性研究的基础上,开展了柑橘全爪螨Hsps基因的克隆、分子生物学特性、转录表达模式及异源表达研究,并结合抗氧化系统,综合分析柑橘全爪螨对热胁迫的响应机制,旨在理解柑橘全爪螨Hsps的分子伴侣功能及其与抗热胁迫的关系,了解柑橘全爪螨抗氧化系统在抵御热胁迫方面发挥的重要作用,揭示柑橘全爪螨乃至其他昆虫（螨）抗逆机制,为掌握昆虫（螨）种群数量的季节动态提供理论依据。取得的主要研究结果如下：1高温对柑橘全爪螨存活及生殖的影响在室内设置了32、35、38及41℃4个温度梯度,以25℃为对照,分别短时胁迫柑橘全爪螨卵及雌成螨,观察高温对柑橘全爪螨存活及生殖的影响。研究结果表明,随着胁迫温度升高,卵孵化率下降,当胁迫温度达35℃及以上时,各处理的卵孵化率显著低于对照。25℃时,柑橘全爪螨每雌平均总产卵量达53.7粒,在上述高温胁迫1h,柑橘全爪螨的单雌总产卵量呈显著下降趋势,且随着胁迫时间的延长,产卵量继续下降。环境温度为25℃时,柑橘全爪螨雌成螨的平均寿命为12.1天。高温胁迫1h,柑橘全爪螨寿命总体呈缩短趋势,温度上升到35℃以上,差异达显著水平,且随胁迫时间延长,缩短程度加剧。高温胁迫对柑橘全爪螨雌成螨的特定年龄存活率（lx）和特定年龄生殖力（mx）均存在不利影响,且随胁迫温度的升高及时间的延长影响程度增大。2柑橘全爪螨对热胁迫的抗氧化反应热胁迫是导致柑橘全爪螨发生氧化胁迫的因素之一。研究表明,热激或冷激能够干扰机体氧化还原反应平衡,从而导致氧化胁迫。柑橘全爪螨雌成螨在0、5、10、15、32、35、38及41℃条件下分别胁迫1h、2 h及3 h,以25℃为对照,测定柑橘全爪螨的抗氧化反应。结果表明,柑橘全爪螨遭受热胁迫后,其体内CAT和POD活性以及T-AOC在清除ROS的过程中,发挥的作用有限；而SOD在冷激条件下出现先上升后下降的动态趋势,暗示低温诱导SOD的抗氧化反应。GSTs的抗氧化反应无论在热激还是冷激条件下,均出现先上升然后下降的动态趋势。由此可见,SOD和GSTs在柑橘全爪螨抗氧化胁迫反应中发挥着重要作用。作为脂质过氧化的指标之一的MDA,其含量从时间动态上看能够维持在正常水平。综合分析表明,柑橘全爪螨能有效抵御热胁迫造成的氧化胁迫。3柑橘全爪螨RT-qPCR内参基因的筛选运用geNorm和NormFinder两种软件,对柑橘全爪螨已有的7个看家基因Pc5.8SrRNA、PcActin、PcEf-1αPcGapdh. PcRpⅡ、PcSdha及Pca-Tubulin在不同发育阶段和热胁迫下的稳定性进行了评价。发育阶段选取了卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨共5个处理,热胁迫分为冷激（0、5和10℃）和热激（35、38和41℃）,处理时间均为1 h,以25℃为对照。分析结果表明,在柑橘全爪螨不同发育阶段及热胁迫1 h条件下,Pc5.8SrRNA、PcActin及PcSdha的稳定性均较差。在不同发育阶段稳定性较好的是PcRpⅡ;低温胁迫1 h稳定性较好的是PcGapdh和Pca-Tubulin;高温胁迫1 h稳定性较好的是PcRpⅡ。若使用多内参基因评价体系,不同发育阶段最适内参基因数目是2,建议选用PcEf-1α+PcRpⅡ组合；低温胁迫下最适内参基因数目也是2,建议选用PcGapdh+Pca-Tubulin组合;高温胁迫下,在现有内参基因的情况下,较适内参基因数目是3,建议选用PcEf-1 a+PcGapdh+PcRpⅡ组合。本研究采用单个内参基因评价体系,综合上述两种软件评价结果,柑橘全爪螨不同发育阶段及雌成螨高温胁迫下均选用PcRpⅡ作为内参基因；低温胁迫下,选用Pca-Tubulin作为内参基因。4柑橘全爪螨Hsp90和Hsp70家族基因克隆和序列分析4.1 Hsp90利用RT-PCR结合RACE技术,从柑橘全爪螨体内成功克隆获得了1个Hsp90家族基因PcHsp90的cDNA全长序列,GenBank登录号为GQ495086。该基因cDNA全长为2,763 bp,开放阅读框长度为2,193 bp,编码730氨基酸残基。进一步利用Protparam和Scanprosite等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质、保守基序等序列特征。PcHsp90基因编码的氨基酸序列具有5个典型的Hsp90家族特征基序（motif）,它们分别是：NKEIFLRELISNSSDALDKIR、LGTIARS、IGQFGVGFYSAYLVAD、IKLYVRRVFI和GVVDSEDLPLNISRE,且具有细胞质Hsp90 C-端标志性基序“MEEVD",明确了其在细胞中的定位。采用软件MEGA 4.1用邻接法（Neighbor-joining method, N-J法）,从GenBank选取12个不同物种的Hsp90与PcHsp90编码的氨基酸共同构建了系统发育树,其中PcHsp90与朱砂叶螨Hsp90亲缘关系最近,最先聚为一支。然后再与肩突硬蜱Hsp90相聚,而与昆虫纲的亲缘关系较远。应用蛋白质三维结构同源模拟工具SWISS-MODEL,构建了PcHsp90编码的蛋白质三维结构模型,可清楚地看到3个结构域：NBD （Nuleotide binding domain）、MD （Middle domain）和CTD （C-terminus domain）。4.2 Hsp70s同样,从柑橘全爪螨体内成功克隆获得了3个Hsp70家族基因PcHsp70-1、PcHsp70-2和PcHsp70-3的cDNA全长序列,GenBank登录号分别为：GQ495083、GQ495084和GQ495085。PcHsp70-1基因cDNA全长为2,586 bp,开放阅读框长度为1,977 bp,编码658个氨基酸残基；PcHsp70-2基因cDNA全长为2,405 bp,开放阅读框为1,968 bp,编码655个氨基酸残基；PcHsp70-3基因cDNA全长为2,300 bp,开放阅读框长度为2,028 bp,编码675个氨基酸残基。进一步利用Protparam和Scanprosite等生物信息学软件分析了推导的蛋白质理化性质、保守基序等序列特征。上述3个基因编码的氨基酸序列均具有Hsp70家族3个典型的特征基序（motif）。PcHsp70-1和PcHsp70-2编码的氨基酸末端序列为‘’EEVD",是细胞质Hsp70所具有的特征基序,因此二者为细胞质型Hsp70。PcHsp70-3编码的氨基酸末端序列为“KDEL”,为内质网蛋白质的典型特征,判定其为内质网型Hsp70。柑橘全爪螨的3个Hsp70家族基因推导的氨基酸序列之间的相似性如下：PcHsp70-1和PcHsp70-2之间为87%；PcHsp70-1和PcHsp70-3为64.7%；PcHsp70-2和PcHsp70-3为65.8%。从GenBank中下载了来自其他物种的27个Hsp70氨基酸序列与本研究中的3个Hsp70基因推导的氨基酸序列共同构建了系统发育树。该系统发育树分为3支,分别是来自细胞质、内质网和线粒体的Hsp70。与序列分析结果一致,PcHsp70-1和PcHsp70-2首先与其它物种的细胞质型Hsp70聚为一支,PcHsp70-3与其它物种内质网型Hsp70聚为一支。应用蛋白质三维结构同源模拟工具SWISS-MODEL,分别构建了PcHsp70-1、PcHsp70-2和PcHsp70-3编码的蛋白质三维结构模型,它们均含有2个结构域：NBD （Nucleotide binding domain）和SBD （Substrate binding domain）。5柑橘全爪螨Hsp90和Hsp70基因的mRNA表达模式解析采用RT-qPCR技术,以PcRpⅡ做为内参基因,分别测定了PcHsp90、PcHsp70-1、PcHsp70-2和PcHsp70-3四个基因在柑橘全爪螨卵、幼螨、若螨、雄成螨及雌成螨等几个发育阶段的mRNA表达量的变化。结果显示,PcHsp90基因在卵、若螨和成螨阶段均大量表达,PcHsp70-1和PcHsp70-3基因在各发育阶段的表达量变化不大,而PcHsp70-2基因在各阶段的表达量变化非常明显。说明PcHsp90基因与维持基本生命活动和生长发育相关,而PcHsp70-1和PcHsp70-3基因可能是维持基本的生命活动所必须的,PcHsp70-2基因可能与柑橘全爪螨的生长发育密切相关。以Pca-Tubulin做为内参基因,分别测定了柑橘全爪螨Hsp90家族和Hsp70家族的.上述4个基因在低温（0、5和10℃）胁迫1 h后mRNA表达量的变化。结果表明,4个基因在低温胁迫下mRNA表达量均呈下降趋势。说明低温短时胁迫可能诱导其它Hsps和物质表达,从而抑制这4个基因的mRNA表达水平。以PcRpII做为内参基因,分别测定了上述4个基因在高温（35、38和41℃）胁迫1 h后mRNA表达量的变化。结果表明,高温胁迫下,4个基因的表达量随温度升高都呈现上调趋势,其中PcHsp90和PcHsp70的表达量与对照相比变化显著,如41℃处理1 h,PcHsp90基因mRNA表达量为对照的6.75倍,PcHsp70-2基因表达量为对照的28.37倍。说明二者在抵御高温胁迫方面发挥着重要作用。综上所述,PcHsp70-1和PcHsp70-3基因主要与维持生命活动有关,与热胁迫关系不密切；PcHsp90基因参与基本生命活动,并在抵御高温胁迫方面具有重要作用;PcHsp70-2基因与生长发育密切相关,并在抵御高温胁迫方面发挥着重要作用。低温短时胁迫可能诱导其它Hsps或物质表达,从而抑制这4个基因的表达。6柑橘全爪螨Hsp70基因异源表达载体的构建利用BnmHI和NotⅠ的双酶切以及DNA重组技术成功构建了柑橘全爪螨PcHsp70-1、PcHsp70-2和PcHsp70-3基因基于pET 28a（+）的原核表达载体,这为进一步深入研究Hsp70蛋白质特性奠定了基础。综上所述,本研究明确了高温短时胁迫对柑橘全爪螨存活和生殖的影响,为生化及分子水平的研究奠定了生物学基础,从抗氧化角度研究了热胁迫诱导柑橘全爪螨的抗氧化反应。在此基础上,深入分子机制研究,克隆获得了柑橘全爪螨Hsp90和Hsp70家族新基因4个,为准确解析这4个基因的nRNA水平表达模式,运用目前常用的两种软件geNorm和NormFinder软件评价7个候选内参基因,最终确定了柑橘全爪螨不同发育阶段和热胁迫下的最适内参基因。采用RT-qPCR技术,解析了这4个基因在不同发育阶段和热胁迫下的转录水平表达模式,揭示了它们在柑橘全爪螨响应热胁迫中发挥的作用。此外,成功构建了原核表达载体,为今后进一步研究Hsp70基因编码的蛋白质特性奠定了基础。本研究综合运用昆虫生理生化和分子生物学学科知识,全面解析了柑橘全爪螨的热胁迫响应机制,为理解抗氧化系统在有机体抵御热胁迫中的作用及丰富Hsps生理功能的认识等方面均具有重要的价值,同时,为明确昆虫（螨）种群季节动态规律提供了理论参考。
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相关论文文献
- [1].McGregor术式修复中度眼睑全层缺损的临床研究[J]. 中国美容整形外科杂志 2020(05)