肝素寡糖的结构与抗血栓作用机制关系的研究

论文摘要

肝素（heparin）属于糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）类生化药物，主要由糖醛酸（艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸）和葡糖胺及其衍生物通过1，4-糖苷键交替连接形成，其主要重复的双糖单位为-[-α-IdoA-2-SO4-（1→4）-α-D-G1cNSO3-6-SO4-]-（又称三硫酸双糖单位），相对平均分子量（Mr）分布范围为3kD～30 kD。肝素寡糖是将肝素降解获得的平均Mr在1 kD～4 kD的寡糖片段。血栓性疾病是一组因各种原因致使血液在血管内或心脏中由流动的液体变为凝固的固体，致使血流发生不同程度的受阻后所形成的综合病症。肝素在临床上的应用已有七十多年的历史，主要用于抗凝血和防止血栓性疾病，普通肝素治疗血栓存在着出血及血小板减少等副作用，低分子肝素与肝素相比其最大的优势即是减少出血副作用。为了研究肝素寡糖的结构与抗血栓作用的关系，本课题将β-消除降解法制备的肝素寡糖经Bio-gel P6凝聚色谱分离纯化，获得不同结构和不同分子量的肝素寡糖，进行结构测定。在进行一般药理学研究的基础上，研究了不同结构、不同分子量的肝素寡糖对血小板、P-选择素，血管性血友病因子以及蛋白C的影响，从分子水平初步探讨了肝素寡糖抗血栓活性的分子基础和作用机制。本研究取得的结果和结论有以下几个方面：1．利用β-消除降解制备肝素寡糖，用Bio-gel P6凝胶过滤层析进行二次分离，获得相对较纯的四种肝素寡糖HO-1、HO-2、HO-3和HO-4。2．运用紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振波谱(1H-NMR、13C-NMR)和双糖分析技术确定了HO-1、HO-2、HO-3和HO-4各肝素寡糖的主要分子结构。3．测定了四种肝素寡糖的部分理化性质。四种肝素寡糖的平均分子量分别为3356、2061、1614和1297；它们的SO42-／COO-比值分别为2．42、2．0、1．67和2．51；糖醛酸的含量分别为36．52％、33．9％、43．75％和38．5％；抗凝效价分别为33 USPU／mg、9 USPU／mg、5 USPU／mg和4 USPU／mg；抗FXa活性分别为62 IU／mg、40 IU／mg、25 IU／mg和15 IU／mg；比旋度分别为43．08、33．27、26．17和12．83。4．通过对四种肝素寡糖抗血栓作用的研究，表明：①HO-1、HO-2、HO-3和HO-4在81．4 mg／mL剂量下均能抑制ADP诱导的血小板聚集。②四种肝素寡糖均能抑制P-选择素和血管性血友病因子的释放。③HO-1、HO-2、HO-3与HO-4四种肝素寡糖均有一定的蛋白C激活活性，其中HO-1的蛋白C激活活性最强。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 血栓的病理机制
• 1.1 血流改变与血栓形成
• 1.2 血凝系统与血栓形成
• 1.3 血小板与血栓形成
• 1.4 血管内皮细胞与血栓形成
• 1.5 纤维蛋白溶解系统与血栓形成
• 2 肝素的结构与功能
• 2.1 肝素的结构
• 2.2 肝素的生物学功能
• 2.2.1 肝素的抗凝血与抗血栓生成作用
• 2.2.2 肝素的抗肿瘤活性
• 2.2.3 肝素的抗哮喘作用
• 2.2.4 肝素的抗炎作用
• 2.2.5 肝素的抗平滑肌增生作用
• 3 本课题已有的研究基础
• 4 本课题拟解决的问题
• 第二章 肝素寡糖的制备、分离、纯化及其部分理化性质测定
• 1 材料
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 β-消除降解法制备肝素寡糖
• 2.2 Bio-gel P6分离纯化肝素寡糖
• 2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 2.3.1 缓冲液的配制
• 2.3.2 PAGE凝胶的制备
• 2.3.3 电泳
• 2.3.4 染色与脱色
• 2.4 肝素寡糖各组分部分理化性质测定
• 2.4.1 硫酸根/羧酸根测定
• 2.4.2 糖醛酸含量测定
• 2.4.3 比旋度测定
• 3 结果
• 3.1 肝素寡糖分离纯化的结果
• 3.1.1 Bio-gel P6分离肝素寡糖的结果
• 3.1.2 Bio-gel P6第二次分离肝素寡糖的结果
• 3.2 肝素寡糖PAGE电泳的结果
• 3.3 肝素寡糖各组分部分理化性质测定结果
• 4 讨论
• 第三章 肝素寡糖的结构研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 肝素寡糖片段分子量测定
• 2.2 紫外扫描测定
• 2.3 红外光谱测定
• 2.4 双糖分析
• 2.5 核磁共振图谱测定
• 3 结果
• 3.1 肝素寡糖片段的分子量测定结果
• 3.2 紫外扫描测定结果
• 3.3 红外光谱测定结果
• 3.4 肝素寡糖的双糖分析结果
• 3.5 NMR图谱解析
• 3.5.1 HO-2的NMR图谱解析
• 3.5.2 HO-3的NMR图谱解析
• 3.5.3 HO-4的NMR图谱解析
• 3.5.4 HO-1的NMR图谱解析
• 4 讨论
• 附图
• 第四章 肝素寡糖的抗血栓作用机理研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 肝素寡糖抗凝效价的测定
• 2.2 肝素寡糖抗Xa活性测定
• 2.3 肝素寡糖对血小板聚集的影响
• 2.4 肝素寡糖对血小板活化时P-选择素（P-Selectin）释放的影响
• 2.4.1 标本采集
• 2.4.2 ELISA法检测血浆中P-Selectin含量
• 2.5 肝素寡糖对血小板活化时血管性血友病因子（vWF）释放的影响
• 2.5.1 标本采集
• 2.5.2 ELISA法检测血浆中vWF含量
• 2.6 肝素寡糖对血浆中蛋白C活性的影响
• 2.6.1 标本采集
• 2.6.2 蛋白C活性标准曲线制备
• 2.6.3 肝素寡糖激活蛋白C活性的测定
• 2.7 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 肝素寡糖的抗凝效价测定结果
• 3.2 肝素寡糖抗FXa活性测定结果
• 3.3 肝素寡糖对ADP诱导的人血小板聚集的影响
• 3.4 肝素寡糖对血小板活化时P-选择素（P-Selectin）释放的影响
• 3.4.1 P-Selectin标准曲线测定
• 3.4.2 肝素寡糖对血小板活化时P-选择素（P-Selectin）释放的影响
• 3.5 肝素寡糖对血小板活化时血管性血友病因子（vWF）释放的影响
• 3.5.1 vWF标准曲线测定
• 3.5.2 肝素寡糖对血小板活化时血管性血友病因子（vWF）释放的影响
• 3.6 肝素寡糖对血浆中蛋白C活性的影响
• 3.6.1 蛋白C活性标准曲线的制备
• 3.6.2 肝素寡糖对蛋白C活性的激活作用
• 4 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表