肺癌血清蛋白质组学研究中高丰度蛋白质的去除及经HPLC分离后的谱图分析

论文摘要

血清蛋白质组学是蛋白质组学研究中的重要分支,在蛋白质组学的众多的研究对象中,由于血清蛋白质所具有的独特的性质、重要的生理生化功能及研究意义,因此长期以来一直是人们研究的热点。本课题旨在建立血清蛋白质组学研究中去除高丰度蛋白质（High Abundant Proteins, HAP）的方法,然后在此基础上建立高效液相色谱指纹图谱方法学并探讨其在肺癌研究中的初步应用、。本实验进行了血清蛋白质组学研究中离心超滤法去除血清大分子量高丰度蛋白质的研究。实验中将非小细胞肺癌患者血清与20%（v/v）乙腈以体积比1：4混合,将混合后的血清分别加入截留标准分子量（molecular weight cutoff,MWCO）为100,000、50,000、30,000、10,000超滤管中,8000×g,离心15min,滤液真空冷冻干燥后,以超纯水按浓缩10倍复溶,分别应用Tricine-SDS-PAGE和二元梯度高效液相色谱法（High performance liquid chromatography, HPLC）分析比较血清大分子量高丰度蛋白质的去除效果。电泳分离结果显示,与100,000超滤管相比,50,000、30,000、10,000滤过液中大分子量高丰度蛋白质条带明显变窄,而且明显看出随着膜孔径的减小,保留的蛋白质的分子量也跟着降低。且经离心超滤后,HPLC检测结果显示,选用MWCO为50,000的超滤管分离后,血清低丰度蛋白质（Low Abundant Proteins, LAP）分离良好,信息量保留较多,进一步研究其重复性,相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）分别为<0.45%和<5.14%。离心超滤法去除血清中大分子量HAP步骤简便同时兼有富集小分子量LAP的效果。本实验建立了血清蛋白质组学研究中去除血清清蛋白的乙腈沉淀技术。血清经除脂后按血清：水：乙腈=1：2：4.5（v/v/v）比例沉淀分离高丰度清蛋白,应用SDS-PAGE验证去除效果和重复性,并分别对4名健康体检者和非小细胞肺癌患者去除清蛋白前后的凝胶电泳图像进行分析,最后将同一份非小细胞肺癌患者血清与健康体检者血清同时分别应用离心超滤和乙腈沉淀处理,并应用HPLC分离处理后的血清。结果显示经本法去除后,血清清蛋白平均浓度由50.65±2.82 g/L下降为2.50±0.71 g/L,占血清总蛋白比例由65.1%下降为33.3%,去除前后相比有明显差异（P<0.01）。与等量上样原血清电泳结果相比,相对分子量80,000以上的大分子量蛋白被去除,清蛋白条带明显变窄,而被其掩盖的LAP得以显现,分别对4名健康体检者和非小细胞肺癌患者去除清蛋白前后的凝胶电泳图像进行分析结果显示方法重复性良好,对比经两种方法处理血清的HPLC谱图发现乙腈沉淀法在去除大分子量HAP的同时不影响小分子量LAP的保留,而且与离心超滤法相比可以保留更多蛋白质峰。为血清蛋白质组学的进一步深入研究提供了一种经济、简便的血清清蛋白去除方法。实验进一步建立了血清蛋白质组学研究中HPLC指纹图谱方法学,对流动相、柱温、检测波长、共有峰及内标的选择问题进行了研究,并以相对保留时间和相对峰面积为参数分析了方法的重复性、稳定性、精密度。结果显示,在所建立的条件下,内标峰的色谱保留时间约为23分钟,峰型清晰对称,与样品中的其他蛋白分离完全。在健康对照组色谱图中,筛选出11个共有峰,以相对峰面积为参数分析了方法的重复性、稳定性、精密度,其相对标准偏差分别<5.64%、<4.79%、<2.94%,并初步发现健康体检者与肺癌患者谱图存在差异。最后在批量样本中验证了肺癌患者、肺炎患者、健康体检者经上述建立的HPLC指纹图谱方法分离后的谱图差异。选取性别年龄与肺癌患者匹配的41例健康体检者及14例肺炎患者,非小细胞肺癌患者并排除其他疾病患者50例,应用乙腈沉淀技术去除血清清蛋白等HAP后,并应用RP-HPLC技术进行分离小分子量低丰度蛋白质。经内标校正后进行统计学分析,结果显示各共有峰的相对保留时间在各组之间无显著差异,相对峰面积在健康体检者与肺炎患者之间无显著差异,而与非小细胞肺癌患者相比,峰4、峰5、峰6相对峰面积有极显著差异,p<0.001,其他峰差异不显著。本实验为筛选非小细胞肺癌的HPLC指纹图谱奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 血清蛋白质组成及研究工具
• 1.2 液相色谱技术在血清蛋白质组学研究中的应用
• 1.3 血清蛋白质组学在肺癌研究中的应用
• 1.4 结语
• 第2章 血清蛋白质组学研究中高丰度蛋白质的去除
• 第一节 离心超滤法去除血清大分子量高丰度蛋白质的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 乙腈沉淀提取法在去除清蛋白研究中的应用
• 1 材料与方法
• 2. 结果
• 3 讨论
• 第3章 血清蛋白质组学研究中HPLC指纹图谱方法学建立及在肺癌研究中的初步应用
• 第一节 血清蛋白质组学研究中HPLC指纹图谱方法学建立
• 1 材料
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 第二节 血清蛋白质组学研究中HPLC指纹图谱方法在肺癌研究中的初步应用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢