论文摘要
随着全球性人口老龄化问题的日益突出,揭示衰老本质和寻求抗衰老方法、药物的研究已成为当今世界性的重大医学课题。现代医学研究发现在衰老过程中,免疫-神经-内分泌网络起着重要调节作用,而下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴系是其重要组成部分。女性进入围绝经期由于卵巢发生退行性改变,致使HPOA之间制约关系失衡,出现月经紊乱、绝经、植物神经功能失调等临床症候群。目前研究性腺轴衰老机制及药物对其调节作用已成为衰老研究的热点之一,近年来D-半乳糖致亚急性衰老动物模型主要集中在雄性性腺轴衰老的研究,而对于雌性性腺轴衰老的研究报道尚少。传统中医学认为肾虚是衰老的主要原因。我们根据肾虚衰老学说确立了补肾填精原则,制定了补肾方剂-何首乌饮。本研究首先建立D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠模型,以大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴（H-P-O-A）为研究对象,应用生化、高效液相、ELISA、RT-PCR、Western blotting、TUNEL、免疫组化方法等检测抗氧化能力、血脂、神经递质、性激素及其受体、卵巢细胞凋亡率及凋亡相关基因fas/fasl、Bcl-2/Bax蛋白、Caspase-3蛋白表达,旨在从生化-组织-细胞-基因-蛋白水平等不同层面系统研究在衰老过程中,下丘脑-垂体-卵巢轴的衰老变化以及何首乌饮延缓衰老作用情况,为进一步阐明女性衰老机制奠定基础,同时为研究和开发临床抗衰老用药积累资料。第一部分衰老大鼠血清抗氧化能力和血脂的变化及何首乌饮的影响目的探讨D-半乳糖所致亚急性衰老模型大鼠抗氧化能力和血脂的变化,观察何首乌饮对衰老大鼠抗氧化能力和血脂的影响。方法1.模型的建立及分组（1）衰老模型的建立:选用清洁级8周龄雄性SD大鼠105只,体重180～220g（由河北医科大学实验动物学部提供）。按300mg/kg/d腹腔注射D-半乳糖（用生理盐水配成6%的溶液）,连续60d。（2）实验分组:根据实验目的和要求分组情况如下,正常对照组（15只）;将造模成功的大鼠分为模型组（15只）、何首乌饮延缓衰老组（高、中、低剂量组各15只）、自然恢复组（15只）、VE阳性对照组（15只）。2.各实验组大鼠经内眦取血,离心取上清,①分别用生物化学方法检测血清SOD、GSH-Px和T-AOC活力以及MDA的含量。②检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL-C）的含量。结果1.大鼠血清抗氧化能力的改变:D-半乳糖所致亚急性衰老模型组SOD活力、GSH-Px活力和T-AOC均明显下降,MDA含量明显上升,与正常对照组比较差异显著（P<0.05）,与自然恢复组比较无差异（P>0.05）,何首乌饮延缓衰老组SOD活力、GSH-PX活力和T-AOC三者均有显著提高,MDA含量明显下降,与模型组比较差异显著,其含量接近正常组,与自然恢复组比较差异显著（P<0.05）,何首乌饮延缓衰老组和阳性对照组相比较,何首乌饮高剂量效果最好。2.大鼠血清血脂的变化:D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠模型组和正常组相比,TC、TG含量明显升高,HDL-C明显下降;何首乌饮延缓衰老高剂量组TC、TG含量均有显著下降,HDL-C含量明显升高,与自然恢复组比较差异显著（P<0.05）。结论1.应用D-半乳糖成功建立了衰老模型。2.何首乌饮可显著提高D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠血清SOD、GSH-PX抗氧化酶活性,从而提高总抗氧化能力,减少血清MDA的堆积。3.何首乌饮显著降低亚急性衰老大鼠血清TC、TG含量,提高HDL-C含量,从而改善衰老时脂质代谢紊乱状态。第二部分雌性衰老大鼠下丘脑神经递质含量的变化及何首乌饮对其影响的研究目的通过检测各组大鼠下丘脑内GnRH、SP、β-EP和单胺类神经递质NA、DA、5-HT的含量,分析下丘脑衰老时神经递质的变化及何首乌饮延缓下丘脑衰老的作用机制。方法1.大鼠断头取下丘脑,采用ELISA法检测各组大鼠SP、β-EP和GnRH的含量。2.采用高效液相色谱法（HPLC）以SHIMADZU-10A高效液相色谱仪和L-ECD-6A电化学检测器检测下丘脑单胺类神经递质NA、DA、5-HT的含量。结果1.下丘脑GnRH、SP和β-EP的变化:模型组下丘脑GnRH、SP明显增高,β-EP明显降低,与正常组相比有显著差异(（P<0.05）;模型组与自然恢复组之间比较差异无显著性（P>0.05）;何首乌饮能够明显提高β-EP的含量,降低GnRH、SP的浓度,何首乌饮高剂量组明显好于其它各组（P<0.05）。2.单胺类神经递质含量变化:模型组大鼠下丘脑NA、DA、5-HT与正常组相比,含量明显下降（P<0.05）;何首乌饮组同模型组相比,NA、DA、5-HT含量明显提高。以何首乌饮高剂量组效果最显著。结论1.本研究验证了衰老大鼠下丘脑合成NA、DA、5-HT和β-EP减少,GnRH、SP增加,证实下丘脑正常功能被破坏。2.何首乌饮能上调下丘脑β-EP的含量,下调GnRH、SP的浓度,提高NA、DA、5-HT浓度。由此可见何首乌饮通过对神经递质紊乱的调节而延缓了下丘脑的衰老。第三部分衰老大鼠性激素与其受体的变化以及何首乌饮对其影响的研究目的通过免疫组织化学全自动微粒子化学发光法、原位杂交和蛋白印记等技术观察亚急性衰老雌性大鼠性激素及其受体的变化情况和何首乌饮延缓卵巢组织的衰老作用。方法1.脏器指数大鼠处死前称重量。电子分析天平称量大鼠的垂体、卵巢湿重量。垂体指数=垂体湿重/体重×100%,卵巢指数=卵巢湿重/体重×100%。2.通过全自动微粒子化学发光免疫分析方法检测各组大鼠血清LH, E2,FSH的含量变化。3.大鼠经含1‰DEPC的4%多聚甲醛灌注固定,取卵巢,常规石蜡包埋,原位杂交方法检测各组大鼠卵巢细胞FSHR和LHR的变化情况。4.大鼠断头处死,取卵巢,Western Bloting法检测各组大鼠卵巢ER的变化。结果1.血清性激素含量:模型组血清E2含量明显降低、LH、FSH升高,与正常组比较有显著差异（P<0.05）;与自然恢复组相比无显著差异（P>0.05）;何首乌饮延缓衰老高、中剂量组能够显著提高血清E2和降低LH、FSH的含量（P<0.05）,其作用强于VE对照组。2.垂体和卵巢指数:模型大鼠同正常对照大鼠相比,垂体指数和卵巢指数均明显降低（P<0.05）;与模型组比较,阳性对照组和何首乌延缓衰老组均增高（P<0.05）,呈现一定的量效关系。3.卵巢细胞中激素受体的变化:模型组ER、FSHR、LHR的表达与正常组相比明显降低（P<0.05）;模型组与自然恢复组之间无明显差异（P>0.05）;何首乌饮延缓衰老不同剂量组均能明显提高卵巢细胞ER、FSHR、LHR的表达,且成量效关系,随着剂量的增加效果更佳。结论1.衰老大鼠垂体、卵巢指数下降,何首乌饮能提高亚急性衰老大鼠垂体、卵巢指数,使血清E2水平呈升高趋势,说明何首乌饮有类雌激素作用。2.何首乌饮能调节亚急性衰老大鼠体内的性激素水平,对HPOA的多环节具有不同程度的调节作用,可升高血清E2水平,降低衰老时大鼠升高的血清FSH和LH水平,从而有助于恢复HPOA内分泌功能的协调性。3.衰老大鼠性激素受体水平下降,何首乌饮能上调性激素受体的水平,有利于相关激素发挥生物学效应,使HPOA内分泌功能恢复正常,从而改善卵巢功能。目的通过卵巢细胞凋亡及其相关基因和蛋白的检测,探讨衰老时卵巢颗粒细胞凋亡情况及何首乌饮的影响。方法1.采用TUNEL法检测各组大鼠卵巢细胞凋亡情况;2. RT-PCR方法检测fas、fasl基因的表达变化。3.免疫组织化学方法或Western Blotting法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达量的变化。结果1.凋亡:模型组卵巢细胞凋亡率明显高于正常对照组（P<0.05）,与自然恢复组无差异（P>0.05）;何首乌饮延缓衰老组较模型组凋亡率明显下降（P<0.05）,呈现量效关系,以何首乌饮高剂量组效果作用最佳。2.凋亡相关基因和蛋白表达情况:模型组较正常组卵巢细胞fas、fasl基因表达增强,Bax、Caspase-3表达量增加,Bcl-2表达减弱;何首乌饮可使卵巢fas、fasl基因表达减弱,Bax、Caspase-3表达量降低,Bcl-2表达增加。结论1.衰老时大鼠卵巢由于凋亡促进基因Bax、fas、fasl、Caspase表达增加,抑制基因Bcl-2表达降低而导致卵巢颗粒细胞凋亡率增加,造成卵泡闭锁加剧。2.何首乌饮通过降低卵巢细胞凋亡和调控凋亡相关基因及蛋白的表达而达到延缓卵巢细胞衰老的目的。综上所述,我们的研究发现D-半乳糖致衰老大鼠HPOA及相关生化指标发生了一系列衰老变化。何首乌饮通过改善（1）提高机体抗自由基和调节血脂的能力,（2）下丘脑神经递质GnRH、SP、β-EP、NA、DA、5-HT含量;（3）性激素的分泌及受体的表达;（4）降低卵巢细胞凋亡,调节凋亡相关基因;从而达到延缓下丘脑-垂体-卵巢衰老的作用。