核酸条码标识超微量蛋白质检测方法的建立及初步应用

论文摘要

目的:利用纳米技术与传统免疫学检测技术,在制备抗体和寡核苷酸双标记纳米金生物探针和免疫磁性微球基础上,建立一种超微量蛋白质检测技术,即纳米核酸条码标识超微量蛋白质检测技术,为临床检测提供一种快速、简便、准确超微量蛋白质检测新方法。方法:采用氯金酸还原法制备纳米金。基于纳米金粒子与抗体静电吸附作用、与硫醇修饰的寡核苷酸共价结合,建立一步法双标记纳米金生物探针的制备方法。通过透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）、紫外光谱对其进行表征分析和形貌观察,斑点免疫金渗滤法和免疫金银光镜染色技术观察探针上抗体活性,变性PAEG电泳和荧光标记法检测寡核苷酸的覆盖率和活性。采用反相微乳法制备Fe3O4/海藻酸钠磁性微球,在微球上连接“手臂”分子6-氨基已酸,然后以氯化钙等交联剂将抗体与之连接,制备出免疫磁性微球。利用TEM、考马斯亮蓝法、倒置荧光显微镜、流式细胞仪对免疫磁球的性能特征、抗体连接量和抗体活性进行检测。在建立纳米金生物探针和免疫磁性微球制备技术后,将巯基/生物素化的寡核苷酸片段（Bio-ssDNA-SH）和兔抗人PSA（Prostate specific antigen,PSA）多克隆抗体同时结合纳米金（30nm）。磁性微球连接PSA单克隆抗体制成免疫磁性微球。将免疫磁性微球与待测血清反应,加入纳米金双标记生物探针反应,进行磁分离,通过二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）将特异性结合微球上Bio-ssDNA-SH切下,点样于尼龙膜上,碱性磷酸酶标记的链霉亲合素显色检测Bio-ssDNA,即抗原的检测转化为对核酸条码的检测,建立纳米核酸条码标识超微量蛋白质检测技术平台,评价该方法检测范围、灵敏度、特异性、重复性、准确性等指标。利用制备前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）检测试剂盒,对确诊15例临床前列腺癌患者血清,45例前列腺增生患者血清,15例其它各种肿瘤患者血清和30例正常人血清进行检测,并与酶联免疫测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）及放射性免疫测定法（Radioimmunoassay,RIA）结果比较,考核临床符合率和与传统方法的相关性。结果:TEM观察及激光散射仪检测制备纳米金粒子粒径,大小均匀,（10±3）nm纳米金粒子同时连接抗体和寡核苷酸后具有良好生物学活性,每个双标记纳米金生物探针表面覆盖（92±20）条寡核苷酸和（8±3）IgG。免疫磁性微球外观为球形、粒径分布均匀、分散性良好、具有较强的磁响应性。考马斯亮蓝法检测每毫克磁性微球可连接118μg抗体,磁性微球交联抗体后,免疫磁性微球表面抗体具有良好的生物活性.。建立的纳米核酸条码标识法超微量蛋白质检测方法,在5mg/ml的免疫磁性微球与10nM纳米金生物探针在1:2的反应体积比例下,可最佳检测PSA抗原,利用核酸条码作为标志Marker,PSA检测的最低值可到1fg/ml,具有良好的重复性和稳定性。对105份已确诊的各种患者血清和正常人血清PSA进行检测,灵敏度为92%,特异性为68%。与ELISA、放射性免疫试剂盒临床标本对比试验中,表明三法的差异无显著性,相关系数r分别为0.950和0.967,相关性良好,K系数为0.918～0.960,吻合度强,与目前临床应用的标准方法检测结果一致。结论:建立的核酸条码标识法超微量蛋白质检测技术,具有灵敏度高,特异性好,适用性广特点,检测下限到达1fg水平,较之传统免疫学检测技术ELISA,检测灵敏度低至2～3个数量级,对临床肿瘤标志物PSA的检测,与临床结果相符性好,与常规ELISA和放射免疫法检测结果具有良好相关性。为临床超微量蛋白质检测提供了一种新的检测技术。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 纳米金及其标记
• 1.1.1 纳米金概述
• 1.1.2 纳米金在标记免疫分析中的进展
• 1.2 免疫磁性微球的应用进展
• 1.2.1 免疫磁性微球的概述
• 1.2.2 免疫磁性微球在肿瘤早期诊断中的应用
• 1.3 本文的研究目的及技术路线
• 第二章 纳米金和纳米金生物探针的制备
• 2.1 前言
• 2.2 材料和试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 纳米金的制备及表征分析
• 2.3.2 纳米金探针的制备及表征分析
• 2.3.3 纳米金探针的标记优化
• 2.3.4 纳米金探针上抗体的鉴定分析
• 2.3.5 纳米金生物探针上寡核苷酸的连接情况分析
• 2.3.6 PCR及DNA印迹检测纳米金生物探针上核酸条码
• 2.4 结果
• 2.4.1 纳米金的制备及表征
• 2.4.2 TEM、紫外分光光度计等对纳米金和纳米金探针的表征分析
• 2.4.3 纳米金-核酸标记效率的优化
• 2.4.4 斑点免疫金渗滤法和免疫金银染色光镜观察纳米金探针上抗体的活性
• 2.4.5 纳米金探针上寡核苷酸的连接情况分析
• 2.4.6 PCR扩增和DNA印迹检测纳米金生物探针上核酸条码
• 2.5 讨论
• 第三章 免疫磁性微球的制备
• 3.1 前言
• 3.2 材料和试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 免疫磁性微球的制备及表征
• 3.3.2 免疫磁性微球抗体连接率的测定
• 3.3.3 免疫磁性微球抗体与抗原作用最佳时间及活性的鉴定
• 3.4 结果
• 3.4.1 免疫磁球的制备原理及表征
• 3.4.2 考马斯亮蓝法测定抗体连接率
• 3.4.3 免疫磁性微球活性观察
• 3.5 讨论
• 第四章 纳米核酸条码标识检测方法的建立
• 4.1 前言
• 4.2 材料和试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 最适反应比例的确定
• 4.3.2 纳米金探针结合最适时间的摸索
• 4.3.3 标准曲线度的评估
• 4.3.5 特异性检测
• 4.3.6 相关统计学分析
• 4.4 结果
• 4.4.1 核酸条码标识检测法原理
• 4.4.2 尼龙膜斑点杂交（方阵滴定法）确定二者反应最适反应比例
• 4.4.3 纳米金探针结合抗原最适时间
• 4.4.4 标准曲线的评估
• 4.4.5 灵敏度的初步验证
• 4.4.6 特异性检测
• 4.5 讨论
• 第五章 PSA临床血清标本检测方法的验证
• 5.1 前言
• 5.2 材料和试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 最适血清稀释度的确定
• 5.3.2 平行性试验
• 5.3.3 临床血清样本特异性和灵敏度的检测
• 5.3.4 准确性
• 5.3.5 重复性检测
• 5.3.6 比对试验
• 5.3.7 统计学方法
• 5.4 结果
• 5.4.1 最适血清稀释度的确定
• 5.4.2 平行性实验
• 5.4.3 临床血清样本特异性灵敏度的检测
• 5.4.4 准确性
• 5.4.5 重复性检测
• 5.4.6 对比验证
• 5.5 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 缩略词表
• 在校期间发表文章
• 致谢