论文摘要
第一部分pEGFP-C2-p21真核表达载体的构建和p21cip1基因稳定转染的HepG2细胞系的建立目的:构建并鉴定真核表达载体pEGFP-C2-p21,并将重组质粒转染入人肝母细胞瘤细胞株HepG2中,筛选出阳性细胞克隆。方法:将p21cip1全长cDNA片段克隆入真核表达载体pEGFP-C2,经双酶切、菌落PCR及测序鉴定,构建包含目的基因p21的重组质粒pEGFP-C2-p21。利用脂质体介导pEGFP-C2-p21质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜观察HepG2细胞的转染效率,并采用含G418的培养基筛选以获得整合了p21的阳性细胞克隆,提取细胞总RNA待用。结果:（1）构建完成能够稳定表达和具有筛选特征的pEGFP-C2-p21质粒载体,测序结果与预期设计完全一致。（2）转染后经荧光显微镜检查可见pEGFP-C2-p21表达绿色荧光蛋白的阳性表达细胞,并采用G418筛选获得足够数量阳性克隆的含野生型p21的HepG2细胞。结论:成功构建真核表达载体pEGFP-C2-p21,筛选获得高表达p21的HepG2阳性克隆细胞,可供后续研究使用。第二部分p21cip1对肝母细胞瘤细胞内survivin转录的影响及调控机制的探讨目的:研究细胞周期依赖性激酶抑制蛋白cip1/waf1（简称p21）对人肝癌细胞中survivin转录抑制的调控,并探讨相应机制。方法:阿霉素处理人肝母细胞瘤细胞株HepG2,亦运用脂质体法将质粒pEGFP-C2-p21导入HepG2并用G418筛选;实时PCR定量检测p21、p53及survivin的mRNA表达,流式细胞术、逆转录PCR分析转染后细胞周期的变化,E2F-1和p300 mRNA的变化情况。结果:（1）阿霉素处理后诱导了p53及p21基因表达的增高,且24 h内伴有survivin表达的降低;（2）稳转后可显著增加p21 mRNA的表达,是HepG2组、HepG2-C2组的2100.11倍及980.89倍;且survivin mRNA的水平也显著下调,分别是两对照组的0.54%及0.59%;但p53 mRNA的表达无明显影响。（3）p21转染后,将细胞周期阻滞在G0/G1期（F = 31.59, P < 0.01）;转录因子E2F-1、p300的mRNA含量亦已降低（F E2F-1 = 125.28, P < 0.05与F p300 = 46.01, P < 0.01）。结论:p21可能通过抑制survivin的转录调控因子E2F-1和p300,从而抑制HepG2细胞中survivin的表达,并导致G1期的阻滞。第三部分阿霉素联合p21cip1基因对人肝母细胞瘤细胞株HepG2增殖的影响目的:阿霉素类是治疗肝母细胞瘤的传统化疗药,但近年来其疗效不佳是困扰临床的一大问题,目前配合基因治疗提高阿霉素的疗效,是肝母细胞瘤治疗发展的新趋势。本实验研究p21基因与阿霉素联合对人肝母细胞瘤HepG2细胞增殖的影响。方法:实验分转染组和联合处理组。转染组为空白对照组、pEGFP-C2转染对照组、P21转染组;联合处理组为空白对照组、单独药物组、P21转染组及P21转染+药物联合组。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染后HepG2细胞的生长趋势及联合处理后细胞增殖抑制状况;荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）检测转染后p21 mRNA的表达水平,联合处理后survivin mRNA水平的变化。结果:转染后,p21转染组在第3天和4天的生长速度明显慢于两对照组（P<0.01）;经鉴定其有p21 mRNA表达量的增高,是空白对照组的2100.11倍（P<0.05）。以空白组为对照,在第35天,联合组增殖抑制率明显高于单独加药组和p21转染组（第3天:43.92% vs. 32.97%,35.77%, P<0.01;第4天:59.86% vs.39.35%,40.96%,P<0.01;第5天:51.81% vs.33.91%,10.68%,P<0.01）;且1～4 d内随合用时间的延长,抑制效应增强（r=0.91, P<0.05）,并在第4天时较显著（Q=1.07）。荧光定量PCR显示,联合组survivin mRNA水平显著低于单独加药组;与p21转染组比较,联合作用仅在48 h时差异有统计学意义（P<0.01）。结论:在一定时间范围内p21可增强阿霉素对HepG2细胞的增殖抑制作用,降低胞内survivin mRNA的表达。
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标签：基因论文; 转染论文; 绿色荧光蛋白论文; 肝脏肿瘤论文; 基因表达调控论文; 细胞论文; 阿霉素论文; 增殖论文;