农杆菌介导的苹果DHAR和MDHAR基因转化苹果和番茄的研究

论文摘要

抗坏血酸（Asorbic Acid,AsA）即维生素C （Vc）,在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。提高植物尤其是果实产品抗坏血酸的含量,不仅可以增加植物产品的营养品质,还能增强植物本身对逆境的抗性。植物体内,抗坏血酸在抗坏血酸过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶的作用下,氧化成单脱氢抗坏血酸。单脱氢抗坏血酸不稳定,在单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的作用下重新转变成抗坏血酸,或者在没有酶的作用下代谢成脱氢抗坏血酸。脱氢抗坏血酸可自发水解成2,3-二酮古洛酸,或者利用还原型谷胱甘肽（GSH）作为还原剂,在脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的作用下,重新生成抗坏血酸。脱氢抗坏血酸还原酶和单脱氢抗坏血酸还原酶对于抗坏血酸的再生具有重要作用。本试验以苹果和番茄为材料,利用农杆菌介导法,将从苹果中克隆到的DHAR基因和MDHAR基因对绿袖苹果和番茄进行了转化研究,同时对转化得到的番茄植株叶片中抗氧化系统酶活性进行了测定。为研究DHAR和MDHAR两个再生酶在抗坏血酸循环中的作用提供了理论依据。主要研究结果有以下几点:1以绿袖苹果组培苗叶片为材料,研究了不同的激素组合不同叶龄,不同叶片放置方式对其再生的影响,优化了绿袖苹果再生体系。最佳再生培养基为6-BA5.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂（pH5.8）。最佳叶龄为继代20天的顶端完全伸展开的2-3片叶片,叶片近轴端贴近培养基比远轴端贴近培养基具有显著高的再生率。2以苹果叶片为受体,利用农杆菌介导法将Vc代谢再生关键酶基因DHAR和MDHAR转入到苹果中,分别得到了苹果转化植株。3以番茄“s以12粉”试管苗的子叶和下胚轴为外植体,研究了不同的激素浓度组合对番茄生体系的影响,优化了番茄再生体系。结果表明,以子叶为外植体的再生率远远高于以下胚轴为外植体的再生率,最佳再生培养基为MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA +30 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂（pH5.8）,子叶再生率达到99%。下胚轴再生率最高只能达到75%。4以番茄子叶为受体,利用农杆菌介导法将苹果DHAR基因和MDHAR基因转入到番茄中,得到了12株番茄DHAR转化植株和2株MDHAR转化植株。GUS染色和PCR检测结果表明目的基因DHAR和MDHAR已经转入到番茄基因组中。5对DHAR和MDAHR转化植株APX、CAT、DHAR、MDHAR、GR等酶活性进行了测定。转基因番茄植株的酶活性有所提高,最高提高了2倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 抗坏血酸研究现状
• 1.1.1 抗坏血酸功能
• 1.1.2 植物抗坏血酸的代谢途径
• 1.2 苹果转基因研究现状
• 1.2.1 苹果组织培养的再生技术
• 1.2.2 苹果遗传转化
• 1.3 抗坏血酸再生酶DHAR 和MDHAR 研究现状
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 农杆菌介导的DHAR 和MDHAR 转化‘绿袖’苹果
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料‘绿袖’无菌苗
• 2.1.2 植物表达载体与菌株
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 苹果叶片再生体系的优化
• 2.2.2 农杆菌介导法转化苹果
• 2.2.3 苹果转基因植株的检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 苹果绿袖叶片再生体系的优化
• 2.3.2 农杆菌介导的苹果遗传转化
• 2.3.3 苹果抗性植株的获得以及转基因植株的检测
• 第三章 农杆菌介导法转化番茄品种“S 以12 粉”
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试植物品种
• 3.1.2 植物表达载体和菌株
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 番茄无菌苗的获得
• 3.2.2 番茄植株再生
• 3.2.3 番茄植株的生根
• 3.2.4 数据分析
• 3.2.5 番茄抑菌素浓度确定
• 3.2.6 潮霉素筛选浓度的确定
• 3.2.7 转基因番茄植株的获得
• 3.2.8 转基因番茄植株的检测
• 3.2.9 转基因番茄酶活性的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 番茄最佳再生培养基配方
• 3.3.2 不同浓度的IAA 、IBA 对番茄生根的影响
• 3.3.3 潮霉素筛选浓度的确定
• 3.3.4 转基因番茄植株获得及检测
• 3.3.5 转基因番茄酶活性测定
• 第四章 讨论
• 4.1 苹果叶片再生体系的建立
• 4.2 头孢霉素对转化的影响
• 4.3 潮霉素选择压的探讨
• 4.4 GUS 基因的表达
• 4.5 转基因植株的抗逆性
• 第五章 结论
• 附图
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介