蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1嵌合体小鼠的研究

论文摘要

蜘蛛拖丝由于具有独特的抗拉性和弹性的力学特性而备受关注。随着对蜘蛛丝的化学组成、分子结构及基因序列等了解的加深,诸多学者探讨了采用基因工程技术,通过山羊乳腺、细菌、烟草或马铃薯和家蚕等获得蜘蛛丝蛋白的方法,但均未能获得理想的效果。本研究以小鼠为实验动物模型,利用蜘蛛拖丝蛋白基因2S、pIRES2-EGF载体和PMX载体构建逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP,并经platE细胞包装获得2S假病毒,探讨了通过假病毒感染小鼠ES细胞,再通过囊胚注射制备整合有目的基因嵌合体小鼠的方法,为最终建立通过转基因动物获取蜘蛛拖丝蛋白的方法奠定基础。本研究的结果如下：1. PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体的构建将蜘蛛拖丝蛋白基因2S与载体pIRES2-EGFP连接,酶切获得2S-IRES-EGFP片段后与逆转录病毒载体PMX相连,构建既表达蜘蛛拖丝蛋白基因2S又能表达绿色荧光蛋白基因GFP的逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP;双酶切和PCR检测及序列分析结果显示,该载体与所设计的理论序列一致。2.2S假病毒的获得及其滴度检测采用脂质体法将逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-GFP转染platE和293GP细胞后的第48h,表达GFP的platE细胞数量明显高于293GP细胞；另外,当采用磷酸钙法转染platE细胞时,在转染后的第48h约有90%的细胞表达GFP。用上述方法获得的2S假病毒感染NIH-3T3细胞,不仅能够检测到GFP的表达,而且检测到目的基因2S-IRES-EGFP在阳性NIH-3T3细胞基因组中整合。经计算2S假病毒滴度达到2×105cfu·mL-1。3.小鼠ES细胞的传代培养通过不同发育时期的胎鼠皮肤成纤维细胞、丝裂霉素C处理时间及细胞培养密度的筛选,获得了最佳的饲养层细胞,并建立了ES细胞的培养体系；利用该体系对馈赠获得的小鼠ES细胞进行培养后,其细胞形态、细胞增殖特性正常；将传代培养的ES细胞经冷冻复苏后,仍保持ES细胞形态和生长特性,且培养后的第72h,细胞克隆达培养皿面积60%以上。4.小鼠ES细胞的检测将上述培养的ES细胞用碱性磷酸酶试剂盒染色后,呈现碱性磷酸酶阳性；将ES细胞用多能性因子检测试剂盒进行免疫组化染色后,在倒置荧光显微镜下可检测到SSEA1、Oct4、Nanog和Sox2的表达。5.ES细胞2S假病毒的感染用2S假病毒感染小鼠ES细胞并扩大培养,续培养的第24h可观察到大量GFP阳性细胞克隆；经PCR鉴定,阳性细胞基因组中可检测出与与理论序列一致的2S-IRES-EGFP目的基因条带（约750bp处）；核型分析结果显示,约有70%的阳性细胞具有正常的2n=40条染色体。6.阳性ES细胞嵌合体小鼠的制作采用小鼠囊胚注射制作嵌合体方法,将阳性ES细胞注入90个来源于雄性C57BL/6和雌性ICR小鼠的囊胚,共获得77个正常的重构囊胚,将其中的70个重构胚移植于5只假孕雌性小鼠的子宫后,2只怀孕并分娩13只,其中存活11只（雄性7只,雌性4只）。在11只幼鼠中有5只尾部出现嵌合（白色斑块）。7.嵌合体小鼠的检测提取11只嵌合体小鼠的尾基因组DNA后,经PCR检测,有6只小鼠的基因组中检测到2S-IRES-GFP目的条带（约750bp）,与阳性对照（PMX-质粒）扩增条带一致；在载体PMX-2S-IRES-GFP的GFP基因片段上设计探针引物并制备探针,利用制备的探针对经PCR检测为2S阳性的6只鼠尾基因组DNA进行southern blot检测,其结果,在2只鼠尾基因组中检测到了整合位点；提取经southern blot检测有目的基因整合的一只小鼠内脏和肌肉组织的基因组DNA,并利用探针引物进行PCR检测,其结果,在肌肉、心脏、肝脏、肺、胃、肠、胰腺和睾丸中检测到了的目的条带（约为250bp）。8.嵌合体小鼠F1代的检测将经鼠尾基因组PCR和southern blot检测为阳性的雄性小鼠与嵌合体雌鼠进行交配后,获得10只幼鼠（雄性6只,雌性4只）。分别提取10只幼鼠的尾基因组DNA,并采用PCR法进行检测,其结果,嵌合体小鼠的F1代中,有9只小鼠的基因组DNA中检测到2S-IRES-GFP目的条带（约750bp）。综上所述,本研究利用蜘蛛拖丝蛋白基因2S、pIRES2-EGF和PMX载体构建了PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体,建立了通过小鼠ES细胞囊胚注射获得转蜘蛛拖丝蛋白基因2S嵌合体小鼠的方法,为进一步通过转基因动物获取蜘蛛拖丝蛋白奠定了坚实基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 蜘蛛丝蛋白
• 1.1.1 蜘蛛丝及其理化特性
• 1.1.2 蜘蛛丝蛋白基因结构
• 1.1.3 人工获取蜘蛛丝蛋白的相关研究
• 1.2 逆转录病毒载体
• 1.2.1 逆转录病毒的分类与基因结构
• 1.2.2 逆转录病毒载体的研究进展
• 1.2.3 逆转录病毒载体的构建
• 1.2.4 逆转录病毒载体的应用及展望
• 1.3 绿色荧光蛋白
• 1.4 胚胎干细胞
• 1.4.1 胚胎干细胞的生物学特性
• 1.4.2 胚胎干细胞的研究进展
• 1.4.3 胚胎干细胞的培养
• 1.4.4 胚胎干细胞诱导分化及其应用
• 1.4.5 胚胎干细胞在其它领域的应用
• 1.5 嵌合体的制备
• 1.5.1 嵌合体的研究进展
• 1.5.2 影响嵌合体制作的因素
• 1.5.3 嵌合体动物的鉴定
• 1.5.4 嵌合体应用
• 1.6 研究目的意义
• 2 拖丝蛋白基因2S逆转录病毒载体的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种、细胞系及基因
• 2.1.2 试剂与药品
• 2.1.3 实验试剂的配置
• 2.1.4 实验用载体
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体的构建
• 2.2.2 PlatE细胞和293GP细胞的传代培养
• 2.2.3 PMX-2S-IRES-EGFP转染PlatE和293 GP细胞
• 2.2.4 2S-假病毒滴度的检测
• 2.2.5 拖丝蛋白基因2S在NIH3T3细胞基因组中的整合
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 蜘蛛托丝蛋白基因2S与pIRES2-EGFP表达载体的连接与鉴定
• 2.3.2 PMX-2S-IRES-GFP逆转录病毒载体的构建
• 2.3.3 PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体的检测
• 2.3.4 PlatE和293GP包装细胞特性
• 2.3.5 包装细胞和转染方法对转染效果的影响
• 2.3.6 2S假病毒感染NIH-3T3细胞及滴度测定
• 2.3.7 蜘蛛拖丝蛋白基因2S在NIH-3T3细胞中的整合
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 饲养层的制备及ES细胞培养
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验小鼠与ES细胞
• 3.1.2 实验仪器与试剂
• 3.1.3 溶液的配制
• 3.1.4 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 胎鼠成纤维细胞生长和形态特点
• 3.2.2 冷冻复苏胎鼠成纤维细胞的接种存活率
• 3.2.3 冷冻复苏胎鼠成纤维细胞的生长曲线
• 3.2.4 丝裂霉素C处理时间对MEF的影响
• 3.2.5 细胞密度对饲养层细胞的影响
• 3.2.6 ES细胞的形态和生长特性
• 3.2.7 冷冻复苏对小鼠ES细胞的影响
• 3.2.8 小鼠ES细胞的碱性磷酸酶活性
• 3.2.9 小鼠ES细胞的多能性因子检测
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 4 转蜘蛛拖丝蛋白基因2S嵌合体小鼠的制备
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 试剂与药品
• 4.1.3 溶液的配置
• 4.1.4 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 2S假病毒感染的小鼠ES细胞GFP表达特性
• 4.2.2 GFP阳性ES细胞的PCR鉴定
• 4.2.3 2S阳性ES细胞的核型分析
• 4.2.4 制备2S阳性ES细胞嵌合体小鼠
• 4.2.5 嵌合体小鼠的检测
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢