人肝癌细胞株SMMC-7721中转醛醇酶活性变化与磷酸化关系的研究

论文摘要

转醛醇酶是磷酸戊糖途径非氧化阶段的关键酶,其主要作用在于调控磷酸戊糖途径产生5-磷酸核糖和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,前者是细胞增殖过程中合成核苷酸不可缺少的原料;后者是生物体内重要的还原当量,不仅维持谷光甘肽处于还原状态,还是体内多种代谢反应的供氢体,广泛参与胞内信号转导、抗氧应激等。因此,TAL既是细胞基础代谢所必需的,也与细胞功能转变、代谢状态变化密切相关,近年来的研究表明转醛醇酶在多发性硬化、恶性肿瘤、肝硬化、器官发育、胚胎发生、多种细胞因子引起的细胞凋亡中都起着非常重要的作用。Heinrich等的初步研究发现大鼠肝癌组织中TAL活性显著增高,在分化、再生肝中没有同样变化,提示TAL活性升高似乎对细胞癌变是特异性的。Lachaise等的研究也表明,转醛醇酶与着色性干皮病这一癌前病变的发生之间有相关性。本实验室以往在对小鼠K9细胞转醛醇酶的研究中发现在hCG刺激K9细胞后转醛醇酶活性明显升高,但未发现核酸及蛋白水平同步变化,说明TAL活性的改变不在于基因表达产物的增加,而可能是在此过程中转醛醇酶成熟蛋白受到翻译后修饰所导致。在蛋白质化学中,磷酸化修饰是最常见也是最重要的方式,其可逆性修饰往往导致蛋白质活性和功能发生巨大的变化。鉴于在不同物种中转醛醇酶基因的高度保守性及转醛醇酶蛋白结构的相似性,我们已在人类研究模式初步探讨了转醛醇酶在肝癌组织中活性的变化,本实验试图在此基础上进一步探讨引起转醛醇酶活性变化的原因。本实验共分为两个部分进行:第一部分采用同步化细胞模式研究不同代谢状态下人肝癌细胞中转醛醇酶活性变化及其在核酸和蛋白两个水平的表达情况;第二部分采用磷酸酶消化法分析磷酸化对转醛醇酶活性的影响,应用MTT法检测不同血清浓度对肝癌细胞增殖的影响,并利用蛋白质组学的思路和方法来探讨转醛醇酶在肝癌组织中活性改变的原因,是否与翻译后磷酸化修饰有关,试图解释其在肿瘤发生的分子机制中的作用。第一部分:不同增生状态下人肝癌细胞中转醛醇酶活性差异细胞周期中的G1、S、G2和M各期持续时间和生化过程各不相同,对外界的需求和反应也各不相同。因此,为实验需要可采取一些措施使其进入同步化状态。本实验采用血清饥饿法诱发SMMC-7721细胞同步进入G1期,在此基础上设立实验组和对照组。分别加入含10%和1%胎牛血清的RMPI-1640细胞培养液培养。测定培养1、2、4、8h的TAL活性。同时以RT-PCR方法检测转醛醇酶mRNA水平差异,运用Western blot方法检测转醛醇酶蛋白表达水平差异。结果显示人肝癌细胞株SMMC-7721中TAL活性在10%胎牛血清培养时明显高于1%胎牛血清组,2、4、8h显著性差异（P＜0.05）。10%与1%胎牛血清培养不同时间（2、4、8h）的肝癌细胞转醛醇酶在转录及蛋白两个表达水平皆没有显著性差别（P＞0.05）,与前期组织水平研究结果一致。实验结果显示其活性的改变不在于基因表达产物的增加,而可能是在此过程中转醛醇酶成熟蛋白受到翻译后可逆性修饰所导致。第二部分:磷酸酶消化法分析磷酸化对转醛醇酶活性的影响及转醛醇酶在人肝癌组织及癌旁组织中的表达上述不同血清浓度培养2、4、8h细胞提取总蛋白采用磷酸酶消化法,检测消化前后TAL活性,应用MTT法检测不同血清浓度对肝癌细胞增殖的影响,利用双向电泳检测转醛醇酶在人肝癌组织及癌旁组织中的表达。结果显示:10%胎牛血清组磷酸酶消化后TAL活性较消化前下降（27-46%）,有显著性差异;1%胎牛血清组磷酸酶消化后TAL活性较消化前下降（4.3-16.5%）,无统计学意义。MTT结果显示1%胎牛血清组平均A值明显小于10%胎牛血清组,P＜0.05,1%胎牛血清组的增殖能力比10%组低20-29%;双向电泳结果显示肝癌组织转醛醇酶共有十余个蛋白迁移点,其中对应A亚型有7个点状亚型（spot）,对应B亚型是6个亚型点;而癌旁组织A亚型有7个亚型点、B亚型是5个点,比较转醛醇酶蛋白在肝癌组织和癌旁组织的spots,可见肝癌组织中出现了新的TAL亚型点B6,可能是蛋白等电点向酸性端迁移而致,提示转醛醇酶活性升高可能与磷酸化修饰有关。这是本次研究一个新的发现,在国内外杂志上皆未见有报道。在蛋白质化学中,磷酸化修饰是最常见也是最重要的方式,其可逆性修饰往往导致蛋白质活性和功能发生巨大的变化。通过测量酶促脱磷酸反应后蛋白活性的变化来探讨转醛醇酶活性变化与磷酸化的关系。结果显示:10%胎牛血清组磷酸酶消化后TAL活性与消化前相比呈显著性下降（27-46%）,并且在双向凝胶电泳中出现了TAL蛋白点向酸性端的迁移,说明磷酸化反应确实参与了TAL活性的调节,并且发挥重要作用。总结前面两部分实验的结果,可以认为转醛醇酶作为糖代谢途径的一个关键酶对维持细胞的正常生理功能上是必需的,但除此之外,其酶活性的变化在组织细胞的病变过程中也起着非常重要的作用,甚至有可能成为病变的一个始动因素。对糖代谢酶的其他功能的研究将有可能成为后基因组计划中的一个新的研究方向。

论文目录

• 摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 不同增生状态下人肝癌细胞中转醛醇酶活性差异
• 摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 磷酸化对人肝癌细胞转醛醇酶活性的影响
• 摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 附录:硕士在读期间发表的论文