一种骨桥蛋白小分子肽的重组表达与生物学活性研究

论文摘要

目的:血管损伤部位新生内膜的形成是动脉粥样硬化（AS）和血管成形术后再狭窄（PTCA）病理过程中的重要事件之一,当血管内膜受损时,位于血管中膜的血管平滑肌细胞（VSMC）在生长因子和细胞因子的刺激下由收缩表型转化为合成表型,并获得向内膜下迁移、增殖及合成和分泌大量细胞外基质（ECM）的能力。VSMC迁移主要是由ECM蛋白和细胞表面整合素受体（主要是αvβ3）相互作用所介导的。已经证明,在各种ECM蛋白中,骨桥蛋白（OPN）与细胞迁移和黏附的关系最为密切。OPN通过它所含有的RGD序列与整合素αvβ3、αvβ5相互作用,通过SVVYGLR序列与整合素α9β1、α4β1结合。已经证实,含RGD和SVVYGLR序列的短肽能够竞争性的抑制OPN与多种整合素的结合,从而抑制VSMC以及炎性细胞的黏附和迁移。以小分子肽作为阻断剂研究蛋白质的功能是揭示细胞活动调节机制的重要手段。本实验利用基因重组技术,将含有编码RGD序列的cDNA片段与携带2×His-Trx-S·tag编码序列的原核表达载体pET-32c（+）重组,构建pET-32c-RGD重组子,将其转化大肠杆菌BL21（DE3） ,表达产物为His-Trx-S·tag-RGD融合蛋白（简称His-RGD）。经分离纯化后获得His-RGD纯品,该短肽可作为阻断剂用于研究OPN在体内的生物学作用。方法:1重组表达质粒的构建与鉴定将编码RGD13肽的DNA（以下简称RGD）片段经NcoⅠ/BamH I酶切位点克隆入pET-32c（+）载体,构建His-RGD融合蛋白表达质粒。通过双酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定。2 His-RGD融合蛋白在大肠杆菌中的表达2.1 His-RGD融合蛋白的诱导表达将pET-32c-RGD转化大肠杆菌BL21（DE3）,在不同条件下,用IPTG诱导后可检测His-RGD融合蛋白的表达活性,并对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行筛选优化,确定His-RGD融合蛋白诱导表达的最佳条件。表达产物经SDS-PAGE检查融合蛋白在细胞中的存在形式。2.2 His-RGD融合蛋白的分离纯化取含有表达产物的细菌裂解液上清直接经Ni-NTA His Bind Resin金属离子螯合层析进行纯化。3 His-RGD融合蛋白生物学活性检测3.1黏附抑制实验取3-4代体外培养的VSMC分别与0、150、300、450 mg/L的His-RGD融合蛋白预孵育1 h,然后将细胞接种到用BSA （20 mg/L）或OPN （20 mg/L）包被的96孔板中,检测单位时间（ 2h ）内黏附至孔板上的细胞数,以此表示细胞黏附活性。以融合蛋白洗脱液和2×His-Trx-S·tag蛋白作为平行对照,以确定His-RGD抑制细胞黏附的特异性。3.2伤口愈合实验将VSMC接种于带有玻片的孔板内,待细胞生长至100%汇合后,分别加入0、150、300、450 mg/L的His-RGD预孵育1 h。取出玻片,用无菌吸头在玻片上划痕。随即将玻片放回孔板内,每孔加入20 mg/L OPN或20 mg/L BSA 100μl,继续孵育24 h后,于低倍镜下观察细胞伤口愈合程度,以此表示细胞的迁移活性。以融合蛋白洗脱液和2×His-Trx-S·tag蛋白作为平行对照,以确定His-RGD抑制细胞迁移的特异性。结果:1重组表达质粒pET-32c-RGD的构建与鉴定重组表达质粒经NcoI和BamHI双酶切,产物经核酸电泳鉴定时出现长度为50 bp的插入片段,与预期结果相一致。测序结果显示插入片段的核酸序列正确无误。重组质粒命名为pET-32c-RGD。2 His-RGD融合蛋白的诱导表达转化pET-32c-RGD的宿主菌经IPTG诱导后可表达约18.71 kD的蛋白质,与His-RGD融合蛋白分子量相一致,该融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于胞浆。取培养物（OD600=0.6）按1:50接种于含0.01 mmol/L IPTG的LB培养液中,25℃诱导培养7 h时,His-RGD融合蛋白的表达量最大,此条件作为His-RGD融合蛋白诱导表达的最佳条件。3 His-RGD融合蛋白的纯化经Ni-NTA His Bind Resin金属离子螯合层析进行纯化后,每100 ml培养物可得到约25 mg电泳纯的可溶性His-RGD融合蛋白,纯度为95%。4 His-RGD融合蛋白对细胞黏附的影响黏附抑制实验结果显示,在所观察的浓度范围内,His-RGD融合蛋白能剂量依赖性的抑制VSMC在OPN包被板上的黏附,在融合蛋白为450 mg/L时,抑制效果最明显。5 His-RGD融合蛋白对细胞迁移的影响伤口愈合实验结果表明,His-RGD能剂量依赖性的抑制VSMC迁移,在融合蛋白为450 mg/L时,抑制效果最明显。结论:1成功构建了含有OPN RGD序列13肽基因单拷贝的pET-32c-RGD原核表达质粒。2经过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件进行优化,His-RGD融合蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。3每100 ml培养物经亲和层析纯化可得到约25 mg电泳纯的可溶性融合蛋白,纯度为95%。4 His-RGD融合蛋白能够剂量依赖性的抑制OPN诱导的VSMC的黏附与迁移。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 一种骨桥蛋白小分子肽的重组表达与生物学活性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 生物技术制备小分子肽的研究进展
• 致谢
• 个人简历