论文摘要
在全球范围内每年约有20多万女性死于宫颈癌,在发展中国家宫颈癌尤为常见,成为妇科三大恶性肿瘤之一。其中宫颈鳞癌占宫颈癌的90%以上,其发病率和致死率均居高不下。但是,到目前为止,宫颈鳞癌的发生、发展及形成过程,我们的研究了解还很局限。目前发现子宫颈鳞癌的发生、发展和恶变的过程主要包括基因水平,蛋白水平,组织水平等多方面,多因素的变化,各种条件的协同作用导致了肿瘤形成。膜联蛋白（Annexin）超家族共包括A、B、C、D、E五个家族,其中在脊椎动物细胞中表达的Annexin为A家族。它们在结构上的高度相似性,功能上也有相似之处,比如它们都参与了细胞骨架结构活动、细胞的胞饮和胞吐、细胞膜受体构象和功能的调节、细胞膜离子通道的调控等重要功能。很多国外学者研究发现膜联蛋白家族中的成员在某些肿瘤组织中表达与正常组织出现不同。人类AnnexinA7基因位于染色体10q21,有14个外显子,编码两种亚型,它们的分子量分别为47 kD和51 kD的。在心脏和脑中,两种亚型同时表达,而在其他组织中只有47kD的亚型表达。迄今为止对AnnexinA7的功能研究没有确凿的定论,各个实验报道不尽一致,对它的研究大部分还都仅仅停留在推测和假说的阶段。本实验分别收集人宫颈鳞癌和正常组织,研究两者Annexin A7的表达情况。结果显示,Annexin A7在人宫颈鳞癌表达上调,提示其在人宫颈鳞癌发生过程中起着十分重要的作用。为了进一步研究Annexin A7发挥作用的机理我们首先培养宫颈癌细胞系HeLa细胞,鉴定HeLa细胞中有Annexin A7的表达后,通过siRNA干扰技术,降低Annexin A7在HeLa细胞中的表达水平,观察和检测HeLa细胞在增殖与凋亡方面的变化。初步确定Annexin A7对HeLa细胞的凋亡具有抑制作用后,我们再次应用siRNA干扰技术降低Annexin A7在HeLa细胞中的表达水平,然后应用免疫组织化学法和Western blot观察Bax、Bcl-2、Fas、Fasl和Apaf-1蛋白的表达变化,初步探讨Annexin A7对凋亡的影响及可能通过的凋亡途径,为进一步研究人子宫颈鳞癌的发生机理奠定基础。第一部分膜联蛋白A7在人子宫颈鳞癌和正常组织中的表达研究目的:研究膜联蛋白A7（Annexin A7）在人子宫颈鳞癌和正常组织中的表达情况。方法:1标本采集:于河北医科大学第四附属医院和河北省人民医院收集新鲜宫颈鳞癌组织25例及正常宫颈组织25例,于液氮中保存。于河北省人民医院病理科获得人宫颈鳞癌蜡块25例,正常宫颈蜡块25例,置于4oC冰箱保存。2应用免疫组织化学-SP法在组织水平检测人宫颈鳞癌和正常组织中膜联蛋白A7的表达的情况。3应用Western blot法在蛋白水平检测人宫颈鳞癌和正常组织中膜联蛋白A7的表达的情况。4应用半定量RT-PCR法在mRNA水平检测人宫颈鳞癌和正常组织中膜联蛋白A7的表达的情况。结果:1免疫组化:在组织水平,膜联蛋白A7在宫颈鳞癌组织的表达高于正常宫颈组织（P<0.05）。2 Western blot:膜联蛋白A7在蛋白水平的表达情况为宫颈鳞癌组织表达高于正常宫颈组织（P<0.05）。3 RT-PCR:膜联蛋白A7在mRNA水平的表达情况为宫颈鳞癌组织表达高于正常宫颈组织（P<0.05）。结论:1组织水平Annexin A7在人宫颈鳞癌中的表达比正常宫颈组织显著增高。2蛋白和分子水平Annexin A7在人宫颈鳞癌中的表达比正常宫颈组织高。3 Annexin A7与宫颈鳞癌的发生有关。第二部分膜联蛋白A7低表达对Hela细胞增殖及凋亡的影响研究目的:探讨膜联蛋白A7的低表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖和凋亡是否产生影响。方法:1免疫细胞化学和Western blot鉴定人宫颈癌细胞系HeLa细胞内膜联蛋白A7的表达。2 Western blot鉴定siRNA干扰对膜联蛋白A7表达的抑制效果。3 MTT实验检测siRNA抑制膜联蛋白A7的表达后对HeLa细胞增殖情况的影响。4流式细胞术和激光共聚焦检测siRNA抑制膜联蛋白A7的表达后对HeLa细胞凋亡情况的影响。结果:1免疫组化和Western blot结果均显示Hela细胞内有膜联蛋白A7的表达。2 siRNAR干扰效率的检测显示:siRNA干扰组与阴性对照组、空白对照组比较膜联蛋白A7的表达明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,阴性对照组与空白对照组比较两者无统计学差异（P>0.05）。3 MTT实验显示:siRNA干扰组与阴性对照组、空白对照组比较细胞增殖速度无显著性差异（P>0.05）。4流式细胞术检测实验结果显示:与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组细胞凋亡显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,而阴性对照组和空白对照组比较没有显著性差异（P>0.05）。5激光共聚焦检测结果显示:siRNA干扰组与阴性对照组和空白对照组比较凋亡增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,而阴性对照组和空白对照组比较没有显著性差异（P>0.05）。结论:1膜联蛋白A7的低表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞的增殖未发现明显影响。2膜联蛋白A7的低表达促进人宫颈癌细胞系HeLa细胞的凋亡。3膜联蛋白A7可能具有抑制宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡的作用。第三部分膜联蛋白A7影响Hela细胞凋亡的初步机理研究目的:初步探讨膜联蛋白A7影响HeLa细胞凋亡的可能机理。方法:1应用western blot检测siRNA干扰组、阴性对照组、空白对照组Bax、Bcl-2、Fas、Fasl、Apaf-1的表达情况。2应用免疫细胞化学法检测siRNA干扰组、阴性对照组、空白对照组Bax、Bcl-2、Fas、Fasl、Apaf-1的表达情况。结果:1 Western blot（1）Bax:siRNA干扰组其表达高于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。（2）Bcl-2:siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组比较无显著差异（P>0.05）。（3）Fas:siRNA干扰组其表达高于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。（4）Fasl:siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（5）Apaf-1:siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2免疫细胞化学（1）Bax:siRNA干扰组bax表达增高,与阴性对照组和空白对照组比较有显著性差异（P<0.05）。（2）Bcl-2:siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（3）Fas:siRNA干扰组fas表达增高,与阴性对照组和空白对照组比较有显著性差异（P<0.05）。（4）Fasl:siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（5）Apaf-1:siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1当AnnexinA7的表达被抑制,Bax在siRNA干扰组表达增高,说明ANXA7基因有可能是凋亡抑制基因。2当AnnexinA7的表达被抑制,Fas在siRNA干扰组表达增高,提示ANXA7对Hela细胞凋亡的抑制作用可能是通过死亡受体途径发挥的。