砂梨上苹果茎痘病毒快速检测技术及其外壳蛋白基因克隆和原核表达研究

论文摘要

梨是我国的传统果品之一,栽培面3积和总产量都居世界第一,但其单产和品质都远低于世界先进国家的水平,严重影响了我国梨的出口和创汇。病毒病害是影响其产量和品质的重要因素,对梨造成了严重的危害。苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）对梨的危害就是典型的实例。ASPV是凹陷病毒属（Foveavirus）的代表种,一种潜隐病毒,主要侵染苹果和梨,只在敏感型的砧木上表现症状,常见症状为死顶、内茎皮坏死、嫁接时衰退、叶偏上性生长等,能导致梨产量明显下降和品质改变,严重影响着梨业的发展。 目前,栽培无病毒苗木是解决梨上ASPV危害的有效途径,病毒检测是培育和繁殖无病毒苗木的重要环节。另一方面ASPV在苹果和梨树中的含量极低,且苹果和梨树组织中含有大量酚类等物质,病毒的分离提纯非常困难,国内还没有能制备用于检测ASPV的抗体。 本研究采用生物学、血清学和分子生物学三种方法对砂梨上的ASPV进行了快速检测方法的研究,并成功地克隆了来源于砂梨样品6-1-13上ASPV的外壳蛋白（Coat protein, CP）基因,对其进行了序列测定、原核表达和western-blot分析,具体研究结果如下: 生物学检测:在温室,将常规PAS-ELISA粗检呈阳性的10个砂梨样品通过汁液摩擦接种草本指示植物西方烟（Nicotiana occidentalis‘37B’）,10个样品在西方烟上都产生不规则小斑点,同时6-1-13、6-1-103和4-2-51三个样品产生脉黄症状;通过二重芽接法嫁接木本指示植物,10个样品在杂种棍椁（Pyronia veitchii）上普遍产生叶片反卷、植株矮化、剥开树皮有痘斑的症状,在A20上的症状为叶片上有褪绿叶斑,支脉变黄。结果表明,ASPV采用草本指示植物和木本指示植物检测,症状明显,结果可靠。 血清学检测:采用常规的PAS-ELISA、改进的PAS-ELISA和直接包被抗原ELISA（PTA-ELISA）,检测生物学显症的样品,通过将第二抗与酶标A蛋白预反应后混合加入,可降低非特异反应,提高阳性样品和阴性样品的吸光度比值（P/N）;常规PAS-ELISA与PTA-ELISA检测的结果一致。对样品6-1-13,采用提取缓冲液等倍稀释研磨,结果表明稀释倍数越低,P/N值越高,检测效果越好,一般5倍左右稀释P/N值较高,结果较稳定。该方法安全可靠、快速准确,适合大量样品的检测。 分子生物学检测:参照已报道的ASPV全基因组核苷酸序列设计合成引物,以芽接显症的杂种楹椁叶片为材料,提取dsRNA为模板,分别对6-1-13、4-2-51、4-1-51、

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述:苹果茎痘病毒的研究进展
• 1.1 研究历史及其与其它病毒的关系
• 1.2 生物学特性
• 1.3 粒体形态、体外生物学活性及细胞病理学
• 1.4 基因组结构和组成
• 1.5 检测技术
• 1.5.1 生物学鉴定
• 1.5.2 血清学技术
• 1.5.3 分子生物学技术
• 1.6 防治对策
• 1.7 CP基因抗病毒基因工程的研究进展
• 1.7.1 CP基因抗病毒基因工程的应用
• 1.7.2 CP基因介导抗性机制
• 1.8 目的及意义
• 第二章 砂梨上苹果茎痘病毒的快速检测
• 2.1 ASPV的生物学检测
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 待检砂梨样品
• 2.1.1.2 指示植物
• 2.1.1.3 接种缓冲液
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 汁液摩擦接种
• 2.1.2.2 二重芽接法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 草本指示植物检测
• 2.1.3.2 木本指示植物检测
• 2.1.3.3 草本指示植物和木本指示植物检测结果比较
• 2.1.3.4 接种缓冲液对病毒检测效果的影响
• 2.1.4 结论与讨论
• 2.2 ASPV的血清学检测
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.1.1 待检砂梨样品
• 2.2.1.2 主要试剂
• 2.2.1.3 样品提取缓冲液
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 PAS-ELISA（Protein A sandwich ELISA）检测
• 2.2.2.2 改进的PAS-ELISA检测
• 2.2.2.3 直接包被抗原ELISA（Plate trapped antigen indirect ELISA，PTA-ELISA）检测
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 砂梨上ASPV的潜带状况
• 2.2.3.2 不同检测方法检测结果的比较
• 2.2.3.3 样品最佳稀释倍数的确定
• 2.2.3.4 改进PAS-ELISA方法检测ASPV最佳条件
• 2.2.4 结论与讨论
• 2.3 ASPV分子生物学检测
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.1.1 待检材料
• 2.3.1.2 主要试剂
• 2.3.1.3 引物
• 2.3.2 试验方法
• 2.3.2.1 dsRNA的提取
• 2.3.2.2 反转录合成第一链cDNA
• 2.3.2.3 PCR扩增
• 2.3.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.3.2.5 试管捕捉RT-PCR（TC-RT-PCR）
• 2.3.2.6 PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（PAGE）
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.3.1 以dsRNA为模板的RT-PCR检测
• 2.3.3.2 TC-RT-PCR检测
• 2.3.4 结论与讨论
• 2.4 砂梨上ASPV三种检测方法的综合比较
• 2.4.1 田间样品的病毒检测结果
• 2.4.2 结论与讨论
• 第三章 ASPV的CP基因的克隆及其原核表达
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 质粒、菌株、样品
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 ASPV dsRNA的抽提和CP基因cDNA第一链合成
• 3.2.3 CP基因的PCR扩增
• 3.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.5 特异目标片断的回收与纯化
• 3.2.6 连接
• 3.2.7 质粒转化宿主菌
• 3.2.7.1 感受态细胞的制备
• 3.2.7.2 电击转化大肠杆菌
• 3.2.8 蓝/白斑筛选
• 3.2.9 质粒DNA的制备和纯化
• 3.2.10 重组质粒的鉴定
• 3.2.10.1 PCR鉴定
• 3.2.10.2 质粒酶切鉴定
• 3.2.11 序列测定和分析
• 3.2.12 外源基因的原核表达
• 3.2.12.1 原核表达载体的构建
• 3.2.12.2 载体pE128c质粒的提纯、酶切与纯化
• 3.2.12.3 含目的基因的重组表达载体的获得
• 3.2.12.4 诱导和检测
• 3.2.12.5 SDS-PAGE
• 3.2.12.6 Western-blot
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 CP基因的RT-PCR扩增
• 3.3.2 重组克隆质粒的PCR检测
• 3.3.3 重组克隆质粒酶切检测
• 3.3.4 来源于砂梨样品6-1-3的ASPV CP基因序列分析
• 3.3.5 CP基因在大肠杆菌中的表达
• 3.3.6 原核表达产物的western-blot分析
• 3.4 结论与讨论
• 第四章 研究展望
• 参考文献
• 致谢