猪圆环病毒Ⅱ型多表位疫苗的研究

论文摘要

猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine Circovirus type2）是引起猪圆环相关疾病的主要病原，如PMWS，对世界范围内的养猪业造成了极大地危害。目前，疫苗仍是控制PCV2感染和传播的最有效手段，因此PCV2的疫苗一直是世界各国科学家的研究热点。另外，由于近些年来提出的多表位疫苗具有多项传统疫苗无法比拟的优点，故本试验从猪圆环病毒Ⅱ型多表位疫苗的方向进行研究。对于多表位疫苗而言，载体蛋白的选择和表位的串联决定了免疫效果。本试验采用BCG热休克蛋白65（heat shock protein65）作为载体蛋白，该蛋白不仅具有载体和分子佐剂的作用，还可以协助与其结合的抗原肽进入APC（抗原提呈细胞）内，并进行加工从而与MHC-Ⅰ类分子结合并呈递到其表面，进而刺激并激活抗原特异性CTLS介导的免疫反应。本研究主要是从Cap蛋白上筛选了5个细胞表位，从Rep蛋白上筛选了1个细胞表位，并将这6个表位采用直接串联的方式构建了5个串联重组体，与扩增出BCG的Hsp65基因通过NcoI、SpeI和SalI这三个酶切位点依次克隆到pGEM-T easy载体上，然后再将连接好的片段通过NcoI和SalI连接到表达载体pET30a上，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。最后，将这5种纯化的融合蛋白分别免疫小鼠，并通过特异性抗体水平、淋巴细胞增殖及抗体分型和细胞因子等检测，以确定上述融合蛋白的免疫效果。结果表明，5种融合蛋白的表达量均能达到80%以上，并且western-blot分析发现5种融合蛋白都具有较好的反应原性。这5种蛋白均能刺激机体产生针对PCV2的特异性抗体，并且能产生一定水平的中和抗体，其中HSP-e-2和HSP-e-3的效果比较好；同时这5种蛋白能在不同程度上刺激淋巴细胞增殖，其中HSP-e-3、HSP-e-4和HSP-e-5的效果比较明显。综上所述，单个重组蛋白免疫效果最好的为HSP-e-3，但HSP-e-3引起的细胞免疫水平没有HSP-e-4和HSP-e-5的效果好，因此在后期免疫时我们可以采取HSP-e-1或HSP-e-3与HSP-e-4或HSP-e-5进行混合免疫，因而具有本体动物实验的价值，为猪圆环多表位疫苗的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
• 1.1 猪圆环病毒的研究进展
• 1.1.1. 分类地位
• 1.1.2 形态学及生物学特征
• 1.1.3 PCV1 和 PCV2
• 1.1.4 基因组成
• 1.1.5 PCV 的复制模式
• 1.1.6 仔猪断奶后多系统衰竭综合征
• 1.1.7 PCV2 的致病机理
• 1.2 猪圆环病毒的疫苗研究进展
• 1.3 多表位疫苗的研究进展
• 1.3.1 表位的预测
• 1.3.2 抗原表位的选择
• 1.3.3 多表位疫苗的设计原则
• 1.4 研究的目的和意义
• 第二章 卡介苗 Hsp65 基因的克隆及 PCV2 表位及其串联体的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 基因
• 2.1.2 菌株、载体
• 2.1.3 试剂
• 2.2 卡介苗 Hsp65 基因的克隆
• 2.2.1 卡介苗的培养
• 2.2.2 卡介苗基因组 DNA 的提取
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 Hsp65 基因的扩增
• 2.2.5 Hsp65 PCR 产物的克隆
• 2.2.6 重组质粒的鉴定
• 2.3 PCV2 表位及其串联体的筛选
• 2.3.1 PCV2 抗原表位的筛选
• 2.3.2 表位串联体的筛选
• 2.3.3 表位串联体序列的优化
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 Hsp65 基因的扩增
• 2.4.2. 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定
• 2.4.3 表位串联体的筛选
• 2.5 讨论
• 第三章 重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 重组中间克隆载体的构建
• 3.1.3 重组表达质粒的构建
• 3.1.4 重组表达菌的表达及鉴定
• 3.1.5 融合蛋白的纯化
• 3.1.6 纯化蛋白的复性与加工
• 3.1.7 蛋白浓度的测定
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组中间克隆载体的构建
• 3.2.2 重组表达载体的构建
• 3.2.3 重组蛋白的表达及其鉴定
• 3.2.4 重组蛋白可溶性的确定
• 3.2.5 重组蛋白的纯化及复性
• 3.2.6 蛋白浓度的测定
• 3.3 讨论
• 第四章 重组蛋白免疫效果评价
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 实验材料
• 4.1.3 重组蛋白免疫小鼠
• 4.1.4 ELISA 检测特异性抗体
• 4.1.5 病毒中和抗体的测定
• 4.1.6 T 淋巴细胞增殖实验
• 4.1.7 淋巴细胞 CD4、CD8 分型的测定
• 4.1.8 抗体分型
• 4.1.9 细胞因子 IFN-γ和 IL-4 的检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 特异性抗体的检测结果
• 4.2.2 病毒中和抗体的测定结果
• 4.2.3 T 淋巴细胞增殖实验
• 4.2.4 淋巴细胞 CD4、CD8 分型的测定
• 4.2.5 抗体分型
• 4.2.6 细胞因子 IFN-γ和 IL-4 的检测结果
• 4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历