粟酒裂殖酵母Trz1p核定位序列的进一步研究

论文摘要

tRNase Z是一种核酸内切酶,能去除非编码CCA的tRNA前体3’末端多余核苷酸序列,促进tRNA3’末端加工成熟。tRNase Z属于金属-β-内酰胺酶家族,在生物体中tRNase Z有短型（tRNase Zs）和长型（tRNase ZL）两种形式,不同的生物体中有不同数量不同类型的tRNase Z.本课题主要涉及的研究是粟酒裂殖酵母（Schizosaccharo-myces pombe, S.pombe）核酸内切酶tRNase Z基因的相关功能研究。在裂殖酵母（S.pombe）中编码有两个tRNase ZL基因：分别是sptrzl+（SPAC1D4.10）和sptrz2（SPAC3D6.03c）。本课题重点对裂殖酵母sptrzl+的核定位序列进行进一步分析：利用EGFP作为示踪蛋白,采用逐渐截短基因的方法,构建EGFP与不同截短蛋白的融合蛋白,观察这些融合蛋白的荧光信号分布情况,分析确定各个融合蛋白的核定位序列的细胞定位。实验发现含有208KKRK211的融合蛋白明显的分布在细胞核中,不含这四种氨基酸的融合蛋白的荧光信号散布在细胞核和细胞质中,说明trz1+基因的208KKRK211氨基酸序列在SpTrz1p入核中发挥着重要的作用。这充分证实裂殖酵母sptrzl+基因的细胞定位是在细胞核,其功能的发挥主要是在细胞核中进行。同时,采用合成寡核苷酸的方法结合截短片段的分析,进一步确定裂殖酵母sptrzl+基因中KKRK只有一个核定位序列,其序列分布存在该基因的N端,并且可以初步确定FKKRKHENINRG是其核定位序列。线粒体的tRNA加工方式与核定位的tRNA加工方式存在差异,裂殖酵母sptrz2+基因定位在线粒体,本课题期望通过研究sptrz2+基因的功能,对线粒体的tRNA 3’端加工方式有一定的突破。课题设计利用sptrz2基因温度敏感型菌株,比较温度敏感型菌株与野生型菌株sptrz2+基因tRNA 3’端加工方式的差异,从另一个角度研究分析裂殖酵母线粒体tRNA加工方式。裂殖酵母与细胞凋亡相关的基因pcdl+可能参与细胞凋亡,进一步研究发现其不参与细胞凋亡,参与细胞周期,与细胞发育有关,因此我们希望进一步研究裂殖酵母中pcdl+基因的相关功能。课题设计用随机突变与普通PCR扩增的非高度保真性的方法来构建由pcdl+基因引起的温度敏感型菌株。但遗憾的是经过一定数量的温度敏感型菌株筛选,没有得到特别适合课题需要的温度敏感菌株,为今后筛选温度敏感突变菌株的合适条件探索奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 第1章 前言与综述
• 1 tRNA背景
• 1.1 tRNA的发现
• 1.2 tRNA的加工
• 1.2.1 原核生物tRNA 3'端加工
• 1.2.2 真核生物tRNA前体3'端加工
• 1.3 核酸内切酶tRNase Z
• 1.3.1 tRNase Z的类型
• 1.3.2 tRNase Z的结构
• 1.3.3 tRNase Z功能
• 1.3.4 tRNase Z与疾病
• 1.4 核定位信号序列（Nuclear Localization Signal,NLS）
• 1.4.1 核定位序列的发现
• 1.4.2 核定位序列的种类
• 1.4.3 核定位信号的研究方法
• 1.5 绿色荧光蛋白（GFP）
• 1.6 模式生物---粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） #11展望
• 1.7 裂殖酵母线粒体mRNA3’端加工
• 展望
• 第2章 粟酒裂殖酵母SpTrz1p核定位序列的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 各个截短片段克隆构建
• 2.2.2 验证各个截短克隆片段是否成功插入
• 2.2.3 各个截短质粒线性化
• 2.2.4 各个不同截短片段的共定位结果
• 2.3 讨论
• 第3章 粟酒裂殖酵母线粒体tRNA 3'末端加工机制研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 实验结果
• +引起的温度敏感型菌株的救活实验'>3.2.1 trz2⁺引起的温度敏感型菌株的救活实验
• +引起的温度敏感型菌株yGW的生长曲线测定'>3.2.2 trz2⁺引起的温度敏感型菌株yGW的生长曲线测定
• 3.3 讨论
• +引起的温度敏感型菌株的救活实验'>3.3.1 trz2⁺引起的温度敏感型菌株的救活实验
• +引起的温度敏感型菌株yGW的生长曲线测定'>3.3.2 trz2⁺引起的温度敏感型菌株yGW的生长曲线测定
• +温度敏感型菌株的构建'>第4章 粟酒裂殖酵母凋亡基因pcd1⁺温度敏感型菌株的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 引物
• 4.2 实验方法
• adh1终止子和pcd1+下游序列的pAF1克隆'>4.2.1.构建含T_adh1终止子和pcd1+下游序列的pAF1克隆
• +基因、T_adh1终止子和pcd1⁺下游序列的pAF1的模板克隆'>4.2.2.构建含pcd1⁺基因、T_adh1终止子和pcd1⁺下游序列的pAF1的模板克隆
• +基因、T_adh1终止子、His标签片段、pcd1⁺下游序列的突变片段'>4.2.3.扩增含pcd1⁺基因、T_adh1终止子、His标签片段、pcd1⁺下游序列的突变片段
• 4.2.4 测序载体的构建
• 4.2.5 酵母醋酸锂（Li-Ac）转化目的片段
• 4.2.6 筛选温度敏感菌株
• 4.3 结果
• 4.3.1 易错PCR突变率测定
• 4.3.2 随机易错PCR结果
• 4.3.3 多轮PCR扩增效果
• 4.3.4 温度敏感菌株的筛选结果
• 4.4 讨论
• 第5章 结论
• 附录一 主要仪器
• 附录二 课题所用的酵母菌株
• 附录三 课题所用的质粒
• 附录四 课题所用的引物
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢