半滑舌鳎MHC Ⅱ B两型基因的克隆、多态和表达研究

论文摘要

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是一种重要的经济鱼类,具有生长快等优点。近年来,对其研究主要集中在养殖、发育、群体遗传等方面,对其重要的功能基因如免疫相关基因还知之甚少。主要组织相容性复合体（MHC）是脊椎动物中普遍存在的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群,因其在免疫系统中的重要作用而备受关注。目前已在多种鱼类中扩增得到MHC基因。本文利用RACE技术得到半滑舌鳎MHC II类B基因的cDNA全长,同时扩增研究了其多态性、发现了该基因的两型、获得了两型的基因全长和表达情况等。首先,从实验室构建的半滑舌鳎cDNA文库中得到了MHC II类B基因的完整开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,利用RACE（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术得到了该基因的cDNA全长,共1215bp,其中ORF 750bp,5’末端非翻译区（Untranslated region,UTR）28bp,3’UTR 437bp。在编码的249个氨基酸中,前21个氨基酸组成信号肽,第215到237位氨基酸为跨膜区域,在β1和β2区有4个保守的半胱氨酸残基。生物软件分析表明,该基因编码的氨基酸有1个N连接的糖基化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶II磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、4个豆蔻酰化位点等保守结构;二级结构显示该基因编码的蛋白为混合型蛋白;三维结构和人的DRB的三维结构非常相似。序列比对发现半滑舌鳎MHC II B蛋白和牙鲆、大菱鲆、三刺棘鱼等的MHC II B一致性较高;进化树中首先跟三刺棘鱼聚在一起,然后和牙鲆、大菱鲆、大黄鱼等相聚。设计位于ORF两侧的引物,用高保真酶从9条鱼中扩增该基因的ORF,挑取阳性克隆进行双向测序,结果得到24个非重复序列;这些序列在核苷酸水平上存在明显差异,进化树中聚为两支,分别命名为MhcCyse-DAB1和MhcCyse-DAB2 ,其中MhcCyse-DAB1包含14种等位基因（Cyse-DAB1*0101-Cyse-DAB1*1401）,MhcCyse-DAB2包含8种等位基因（Cyse-DAB2*0101- Cyse-DAB2*0801）;两型均在β1区的变异最大,且核苷酸变异多为非同义替换,因此,24种不同的核苷酸序列产生了22种等位基因;还有两个序列在氨基酸水平上分别和Cyse-DAB1*0101、Cyse-DAB2*0201一样,但核苷酸序列存在差异,将其分别命名为Cyse-DAB1*0102、Cyse-DAB2*0202。其中Cyse-DAB1各等位基因的距离为0.4-6.7,Cyse-DAB2各等位基因的距离为0.4-8.5;Cyse-DAB1各等位基因与Cyse-DAB2各等位基因的距离为8.5-16.6。另外,还发现两个缺失突变的等位基因,分别缺失2bp和7bp,推测为假基因,在核酸水平上分别属于Cyse-DAB1和Cyse-DAB2,因此分别命名为Cyse-DAB1-pse1、Cyse-DAB2-pse1。在检测的9条鱼的mRNA水平上除1条检测不到Cyse-DAB2的表达外,其余均能检测到两型的表达。同时,克隆研究了其中一个个体的3’UTR,发现有2种3’UTR序列,Cyse-DAB1和Cyse-DAB2各有1种,表明两型各至少存在一个位点;但两型之间的3’UTR区差异不大,仅存在2个核苷酸变异和1bp长度差异。随后扩增研究了5个个体的内含子1,得到两型的内含子1各5种,每型的内含子1分别聚成一支,差异明显;表明两型各至少有5个位点,个体分析表明每个个体每型各至少有1-2个位点。利用5’和3’UTR的引物和Extaq扩增得到两型的基因全长。两型均由6个外显子、5个内含子组成,均约2.4kb;在外显子的长度和分布上完全一致,但两型之间和型内内含子的长度和核苷酸存在较明显差异。两型的内含子除内含子1可以作为划分两型的依据外,其它内含子因差异不明显或存在两型的交叉,都不适合作为划分依据。在内含子1、2、4中发现了微卫星序列。内含子的多态也再次说明了该基因的高度多态现象。在mRNA水平检测不到Cyse-DAB2表达的S1个体,也扩增得到了Cyse-DAB2基因全长;没有发现剪切突变或缺失插入突变,推测Cyse-DAB2的表达可能和生理状态有关。用RT-PCR分别检测两型在不同组织和不同发育时期的表达,结果发现两型在不同组织的表达情况类似,在大多数组织中（肝、脾、肾、鳃、脑、心、肠、卵巢、精巢）都表达,而且在脾、肾和心中表达量都较高,在肌肉和鳍中检测不到;但是Cyse-DAB2在鳃、肠、卵巢和精巢的表达不及Cyse-DAB1高。在发育时期中,Cyse-DAB1在受精卵、原肠胚、眼芽和孵化后5-22天有表达,且在孵化后5天表达开始呈现略微下降的趋势;但相同条件下检测不到Cyse-DAB2型在发育时期的表达,说明两型在功能上存在一些差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 鱼类免疫相关基因的研究进展
• 1.1 细胞因子
• 1.2 趋化因子
• 第二节 鱼类主要组织相容性抗原的研究进展
• 2.1 MHC基因的分类
• 2.2 鱼类MHC基因的结构特征
• 2.3 MHC基因的主要功能
• 2.4 MHC的遗传特性
• 2.5 MHC基因在鱼类研究中的应用
• 第二章 半滑舌鳎 MHC II B cDNA的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 总RNA的提取
• 1.3 cDNA文库的构建
• 1.4 3’UTR的获得
• 1.5 产物的纯化，克隆和测序
• 1.6 5’UTR 的获得
• 1.7 序列及系统进化分析
• 2. 结果和分析
• 2.1 半滑舌鳎MHC II B 基因cDNA 全长的克隆
• 2.2 半滑舌鳎MHC II B 序列和结构分析
• 3 讨论
• 3.1 高度保守的MHC II B 基因
• 3.2 半滑舌鳎MHC II B 蛋白的结构和功能
• 第三章 MHC II B 的ORF，3’UTR 和内含子1 的多态研究
• 第一节 MHC II B的ORF多态研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 反转录
• 1.3 ORF 的获得
• 1.4 序列比对和分析
• 2 结果和分析
• 2.1 两型的获得
• 2.2 两型的分布分析及 51 个体的特殊性
• 2.3 缺失突变等位基因的发现
• 3 讨论
• 3.1 半滑舌鳎MHC II B 基因的高度多态性
• 3.2 半滑舌鳎MHC II B 两型的发现
• 3.3 缺失突变等位基因的发现
• 3.4 S1个体的特殊性
• 第二节 MHC II B 的3’UTR 的多态研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 3’UTR 的获得
• 1.3 两型的特异3’UTR 的获得
• 1.4 序列比对和分析
• 2 结果和分析
• 2.1 3’UTR 序列分析
• 2.2 两型序列分析
• 3 讨论
• 第三节 MHC II B 内含子1 的多态研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 DNA 的提取
• 1.3 内含子1 的获得
• 1.4 序列比对和分析
• 2 结果和分析
• 3 讨论
• 第四章 半滑舌鳎 MHC II B 两型基因全长的获得及分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 基因组DNA 的提取
• 1.3 基因全长的获得
• 1.4 序列比对和分析
• 2 结果与分析
• 2.1 两型全长的获得
• 2.2 11 个全长序列的 ORF 分析
• 2.3 11 个全长序列的内含子分析
• 3 讨论
• 第五章 MHC II B 两型基因的组织和发育表达研究
• 第一节 两型基因的组织表达研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 各组织模板的准备
• 1.3 各组织的cDNA 反转录
• 1.4 RT-PCR 半定量反应体系
• 2 结果和分析
• 3 讨论
• 第二节 两型基因的发育表达研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 RNA 提取
• 1.3 反转录
• 1.4 RT-PCR 半定量
• 2 结果和分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 个人简历、发表的学术论文
• 致谢