论文摘要
RNA干涉方法因能序列特异性抑制基因表达而深受基因功能研究者与新药开发者们的青睐。但是,有效siRNA序列的设计和获得仍然停留在低效和随机的水平。随着人类基因组学、转录组学和功能组学等学科的飞速发展,RNAi技术的应用愈加广泛和深入,针对具有高突变性、基因异质性以及重叠基因等多种影响因素存在的复杂基因组,siRNA的优化设计面临更大的挑战。HBV是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒基因组,具有4个重叠开放读码框,具有多基因型异质性和高突变性,是初步研究靶向复杂基因的siRNA优化设计的良好靶点。本研究以HBV基因组为靶点,基于目前相关研究基础,通过全面分析可能影响siRNA活性的一级、二级结构因素,采用定量评价方法对siRNA构效关系进行初步研究,发掘了siRNA设计的一些规律;并在此基础上,考察了不同检测终点与siRNA活性评价之间的相互关系;并对疗效突出的siRNA候选序列进行了可成药性的初步研究。论文主要分两大部分共四章:前言:简要介绍了siRNA优化设计的重要意义,构效关系对于siRNA分析的必要性,以及目前利用RNAi技术对于HBV应用的研究现状和存在问题,并在此基础上提出了论文的研究目的和研究内容。第一部分(第一、二、三章)靶向HBV的siRNA对于抑制S/P mRNA和HBsAg表达的构效关系分析基于HepG2.2.15细胞模型的U95551序列和部分中国患者感染HBV序列的一级结构比对结果,结合三家知名网站按照siRNA设计基本原则设计并提供的上百条siRNA,在低突变区域筛选出21条siRNA(包括文献阳性对照siRNA)。使用DNA一级序列比对程序和mRNA二级结构模拟程序对HBV基因组靶mRNA和多条siRNA进行了HBV基因型同源性分析、二级结构单元(膨胀环、内环、茎、发卡环、多分支环的碱基数)、二级结构热动力学参数等特点分析。体外HBV模型采用HepG2.2.15细胞,建立可以高通量筛选和评价siRNA活性的HBsAg定量方法和实时荧光PCR相对定量方法,对22条siRNA(包括阴性对照siRNA)在三个剂量1nM,10nM和100nM下对蛋白水平HBsAg和mRNA水平S/P基因表达进行确定,从而评价siRNA活性。在设计的21条siRNA中,有15条siRNA与对照组相比显示出有效性(P < 0.05),其中数条siRNA(如537、672、1658等)活性优于阳性对照,可能作为后续研究的候选序列。统计学结果显示半数(13/21)siRNA在本研究的剂量范围内呈现剂量依赖性(P < 0.05)。以S/P mRNA表达水平为因变量进行一级结构多元线性(逐步)回归分析,结果显示:基因型同源性、靶向X区这两个因素对于siRNA活性有密切关系(P < 0.001;P < 0.05)。以HBsAg水平为因变量进行一级结构多元线性(逐步)回归分析结果显示:基因型同源性、靶向S/P区和X区对siRNA抑制HBsAg的表达有密切关系(P < 0.001;P < 0.01;P < 0.01)。值得注意的是,在两者的QSAR分析中,靶向C基因的存在与siRNA抑制S/P mRNA和HBsAg的活性呈负相关(P < 0.05)。对mRNA结合靶部位二级结构单元(发卡、茎、多分支环、茎的碱基数目)与siRNA活性进行了QSAR分析。在数据满足SPSS分析的前提下,对S/P/Pregenome mRNA区域的siRNA靶点进行加权分析二级结构构效关系,结果显示:靶mRNA区域发卡环的存在与相应siRNA的活性呈正相关,即siRNA与该区域靶mRNA结合的发卡环越大,越有效(R = 0.994,P = 0.009),并且预测值与实测值相符,而siRNA与靶mRNA结合区域多分支环和膨胀环的存在是降低siRNA活性的因素(R = 0.994,P = 0.02)。另一方面,在siRNA序列自身二级结构热动力学参数与活性的QSAR分析中,未得出有意义的结论。我们在系统的二级结构构效关系分析中发现,在HBV各基因重叠区域,局部靶mRNA的空间构象极度保守,即同一条siRNA与前基因组mRNA,聚合酶mRNA以及表面抗原mRNA模拟的二级结构结合的靶点空间结构完全相同,且出现频率高(共分析30条,重现率≥50%)。该现象提示同一条siRNA可能同时靶向体内的多条靶mRNA的相同空间区域。对于包括HBV基因组在内的复杂基因来说,这种局部空间结构的高度保守性也可能是siRNA潜在优选靶点的重要特点。第二部分(第四章)确定不同检测终点对于评价复杂基因中靶向不同区域的siRNA活性的影响HBV基因组含有多个重叠基因,同时表达若干产物。研究表明,靶向某特定基因的siRNA可能对与之重叠的其它基因表达产物有交互影响。如靶向C mRNA的siRNA亦可抑制S/P mRNA和S/P蛋白,尽管其活性弱于直接靶向S/P mRNA的siRNA。也就是说,靶向某基因的siRNA对于其它基因对应的检测终点也可能有效。那么,这种有效性是均一的,还是专一的?是否要针对不同的靶mRNA区域选择不同的检测终点来考察相应siRNA的活性,而非选择通用的检测终点来进行评价?对此,我们增加了靶向C/P/Pregenome区的siRNA的条数(源自文献报道的有效siRNA),建立了评价HBV复制的多个检测指标的方法,包括HBeAg ELISA方法,针对C、X基因的mRNA表达水平的测定,HBV DNA病毒含量的测定以及细胞中cccDNA含量测定的定量方法。考察了10nM固定浓度下24条siRNA对各检测终点的抑制程度。分别以各考察指标为因变量进行多元线性回归逐步分析,结果表明,靶向S区和C区的siRNA与对应的检测终点有相关性。首先,以C/P mRNA和HBeAg为因变量进行方差分析,得到的siRNA的有效性排序与之前不同;其次,以C基因的对应检测终点(C mRNA和HBeAg)为因变量分析,靶向C区的siRNA较靶向S区的siRNA效果好(P < 0.05),反之亦然(P < 0.05)。结果表明,对于复杂重叠基因,虽然根据各基因的功能和体内形成特点不同,存在着影响终产物的交错环节,但选择不同的检测终点对于siRNA活性进行个体化评价对于有效siRNA的筛选和潜在治疗药物候选序列的确定是有重要意义的。