“证候-基因组”的方法学及家系虚寒证的代谢基因表达谱研究

论文题目: “证候-基因组”的方法学及家系虚寒证的代谢基因表达谱研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 中西医结合基础

作者: 吴斌

导师: 王米渠

关键词: 证候基因组,家系,虚寒证,基因芯片,支持向量机

文献来源: 成都中医药大学

发表年度: 2005

论文摘要: 背景 人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来为中医证候的研究带来了新的机遇,如何实现“证候-基因组学”阐释是目前中医药研究的热点,但“证候-基因组”研究面临着诸多的困惑,故“证候-基因组”的方法学研究对于解决目前研究中面临的困惑具有积极的意义。墨守成规与妄自菲薄都不是科学的态度,本着实事求是的治学精神,为“证候-基因组”研究探索新路。 目的 ① 建立“证候-基因组”研究的方法学平台; ② 研究家系虚寒证的差异基因表达谱。 方法 ① 理论:系统整理国外基因芯片文献,从理论的角度对基因芯片的实验流程和数据分析进行了系统的分析,为正确应用基因芯片技术提供理论平台。以OMIM数据库为基础,以中医整体观和天人相应观为指导思想,以现代医学模式为参照,建立中西医结合基因模糊分析系统,为“证候-基因表达谱”研究提供临床应用的信息挖掘平台。即从理论的角度对“证候-基因表达谱”进行方法学探讨。 ② 实验:从医学的异病同证、遗传学的家系、分子生物学的基因表达、数学上的生物统计、生物信息学的信息挖掘等多学科结合,精选一个家系虚寒证为研究对象,采用直接、间接比较和以药测证3种实验方案,研究虚寒证的差异基因表达谱。以间接比较的差异表达基因为基础建立虚寒证的支持向量机判别模型,同时应用RT-PCR和qPCR的方法对差异表达基因进行临床验证。即从实证的角度对“证候-基因表达谱”进行方法学探讨。 结果 ① 系统地分析了实验设计和芯片实验的影响因素,以及21种数据分析方法的优缺点,在此基础上提出选择“证候-基因表达谱”实验方案的建设性意见。 ② 建立了中西医结合基因模糊分析系统,该系统是以主题词检索OMIM数据库而建立的本地数据库,其包括现代医学疾病410种,中医证候等词条80条,遗传相关50条,基因性质相关150条,环境相关200条,心理相关150条,社会相关30条,其它130条,共1200条。

论文目录:

论文图略

中文摘要

英文摘要

缩略词

前言

1.“证候-基因组”的提出

1.1 证候研究的重要性

1.2 证候研究的现状

1.3 证候研究的新方法—基因组

2.“证候-基因组”的理论基础

2.1 整体观与人类基因组

2.2 辨证论治与人类基因组

3.中西医比较与基因组学研究

4.“证候-基因基因表达谱”研究的困惑

4.1 方法论的困惑

4.2 实验重复性差的困惑

4.3 面对海量数据的困惑

4.4 临床应用的困惑

5.“证候—基因表达谱”的研究前瞻

上篇：方法平台——基因芯片及数理分析

“证候-基因表达谱”的方法学研究示意图

1.基因芯片技术的发展史与原理

1.1 基因芯片技术的发展历史

1.2 基因芯片技术的原理

1.2.1 芯片制备

1.2.2 样品制备

1.2.3 杂交反应

1.2.4 杂交结果的检测和分析

1.2.5 不同芯片类型的性能比较

2.影响基因芯片实验设计的因素

2.1 研究目的是实验设计的基础

2.1.1 类别比较(Class comparison)

2.1.2 预兆预报(Prognostic Prediction)

2.1.3 类别找寻(Class Discovery)

2.2.基本的实验设计方案

2.2.1 单因子实验设计(Single-factor Experiment Design)

2.2.1.1 参照设计(Common Reference Design)

2.2.1.2 平衡区组设计(Balanced Block Design)

2.2.1.3 环形设计(Loop Design)

2.2.2 时间序贯设计(Time Course Experiment Design)

2.2.3 复因子实验设计(Multiple-factor Experiment Design)

2.3 影响实验设计的因素

2.3.1 重复实验与实验设计

2.3.2 混合样本与实验设计

2.3.3 样本规模与实验设计

3.基因芯片实验的影响因素

3.1 生物芯片的制作

3.1.1 芯片片基

3.1.2 芯片的制作

3.1.2.1 原位合成法—寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip)

3.1.2.2 点样法—cDNA芯片(cDNA Microarray)

3.2 待检测样品制备

3.2.1 待检测样品的采集

3.3 mRNA扩增技术

3.3.1 扩增与非扩增

3.3.2 不同的扩增方法

3.4 探针标记技术

3.4.1 直接标记

3.4.2 间接标记

3.4.3 3DNA树状分子标记

3.5 基因芯片的杂交技术

3.6 基因芯片扫描

3.6.1 荧光芯片扫描仪

3.6.1.1 激光共聚焦芯片检测仪

3.6.1.2 CCD生物芯片检测仪

3.6.2 影响基因芯片扫描的因素

3.7 图像分析

3.7.1 图像分析的定位过程

3.7.2 图像分析的分解过程

3.7.3 图像分析的信息提取过程

4.基因芯片数据分析的影响因素

4.1 数据分析的目的

4.2 数据预处理

4.2.1 数据的描述

4.2.2 数据过滤

4.2.3 缺失值的估计

4.2.4 数据质量控制

4.2.5 数据的归一化

4.2.5.1 归一化的参照对象

4.2.5.2 归一化的计算方法

4.2.5.3 归一化的类型

4.3 数据分析

4.3.1 差异基因表达分析(Difference Expression, DE)

4.3.1.1 倍数变化(Fold Change, FC)

4.3.1.2 t检验(T-test)

4.3.1.3 方差分析(Analysis of Variance, ANOVA)

4.3.1.4 非参数分析(Nonparametric Analysis)

4.3.1.5 回归分析(Regression Analysis)

4.3.2 聚类分析(Clustering Analysis)

4.3.2.1 分层聚类法(Hierarchical Clustering, HCL)

4.3.2.2 K-均值聚类(K-means Clustering，KMC)

4.3.2.3 自组织映射图网络(Self-organizing Map Clustering，SOM)

4.3.2.4 双向聚类(Two-way Clustering，TWC)

4.3.2.5 混合聚类法

4.3.3 判别分析(Discriminant Analysis)

4.3.3.1 费希尔判别分析(Fisher Discriminant Analysis，FDA)

4.3.3.2 贝叶氏网络(Bayesian Networks)

4.3.3.3 支持向量机(Support Vector Machines，SVMs)

4.3.3.4 决策树(Decision Trees)

4.3.3.5 人工神经网络法(Artificial Neural Network，ANN)

4.4.其它分析

4.4.1 主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)

4.4.2 基因网络分析(Gene Network Analysis)

4.5 基因表达数据库的建立

4.6 基因芯片数据分析软件

4.6.1 统计软件与基因芯片数据分析

4.6.2 基因芯片分析软件

4.6.2.1 探针设计相关软件

4.6.2.2 图像分析相关软件

4.6.2.3 数据预处理相关软件

4.6.2.4 数据分析相关软件

4.6.3 数据分析软件

4.6.3.1 R统计语言及软件包

4.6.3.2 网络分析平台

4.6.3.3 综合分析软件

4.6.4 基因网络分析软件

5.基因芯片数据的验证

6.讨论

6.1 实验设计的选择

6.2 芯片的设计与选择

6.3 芯片重复

6.4 基因芯片实验技术

6.5 基因表达谱的数据分析

中篇 信息挖掘——中西医结合基因模糊分析系统

中西医结合基因模糊分析系统思路图

1.信息挖掘与生物信息学

2.信息挖掘与在线人类孟德尔遗传

2.1 OMIM的特点

2.2 OMIM的主要组成

2.3 OMIM的主要意义

3.中西医结合基因分析系统

3.1 中西医结合基因分析系统的设想

3.2 中西医结合基因分析数据库的建立

3.3 中西医结合基因分析系统的功能

3.4 中西医结合基因分析系统的模糊性

3.5 中西医结合基因分析系统的意义

3.5.1 弥补功能基因研究的滞后性对“证候-基因表达谱”研究的影响

3.5.2 提高文献检索的效率

4.中西医结合基因分析系统的应用举例

5.讨论

5.1 中西医结合基因模糊分析系统与系统生物学

5.2 中西医结合基因模糊分析系统的临床应用

5.3 中西医结合基因模糊分析系统的局限性

下篇：代谢基因——一个家系虚寒证的生物学特征研究

家系虚寒证的差异基因表达谱研究示意图

1.病例的选择

1.1 虚寒证辨证因子及等级量化标准的制定

1.1.1 辨证要素的确定

1.1.2 辨证要素的评分制定原则

1.1.2.1 以现代医学的正常值为参考

1.1.2.2 以辨证要素的性质特征和程度为参考

1.1.2.3 以伴随条件为参考

1.1.2.4 以持续时间为参考

1.1.2.5 以发作频率为参考

1.1.2.6 以诱发因素为参考

1.1.3 评分细则

1.1.4 操作说明

1.1.5 虚寒证的判断标准

1.1.6 虚寒证轻重程度的划分

1.2 家系的选择

1.2.1 中医诊断及家系选择标准

1.2.2 西医诊断标准

1.2.3 排除标准

1.3 治疗

1.3.1 治疗方案

1.3.2 疗效判定

1.4 家系虚寒证筛选结果

1.4.1 家系虚寒证选择情况

1.4.2 虚寒证量表评分分析

1.4.3 家系内虚寒证与正常人比较

1.4.4 证候程度判断

1.4.5 疗效

2.基因芯片实验

2.1 间接比较和以药测证

2.1.1 标本的采集与分离白细胞

2.1.1.1 主要仪器与试剂

2.1.1.2 实验步骤

2.1.2 RNA的提取

2.1.2.1 主要仪器与试剂

2.1.2.2 实验步骤

2.1.2.2.1 物品器械的去RNA酶处理

2.12.2.2 总RNA的提取

2.1.2.2.3 总RNA的纯化

2.1.2.2.4 RNA样品质量的检测

2.1.3 基因芯片的制备

2.1.3.1 主要仪器与试剂

2.1.3.2 基因芯片的制备过程

2.1.4 基因芯片的杂交

2.1.4.1 主要仪器与试剂

2.1.4.2 基因芯片的杂交过程

2.1.5 基因芯片的扫描

2.1.5.1 主要仪器与试剂

2.1.5.2 基因芯片的扫描过程

2.1.6 实验结果

2.2 直接比较

2.2.1 采样、总RNA提取、反转录cDNA、标记

2.2.2 芯片杂交

2.2.3 扫描与分析

2.2.4 实验结果

3.数据分析及信息挖掘

3.1 间接比较的数据分析

3.1.1 数据预处理

3.1.1.1 原始数据基本情况

3.1.1.2 数据转换

3.1.1.3 合并重复基因

3.1.1.4 缺失值的处理

3.1.1.5 数据的归一化

3.1.2 差异基因分析

3.1.2.1 ANOVA分析

3.1.2.2 差异基因的聚类分析

3.1.2.2.1 样本的聚类分析

3.1.2.2.2 虚寒证与正常人的基因聚类分析

3.1.3 其它分析方法分析

3.1.3.1 K平均聚类分析(KMC)

3.1.3.2 自组织图分析(SOM)

3.1.3.3 主成分分析(PCA)

3.1.4 信息挖掘

3.1.4.1 虚寒证相关基因的Gene Ontology信息挖掘

3.1.4.1.1 FatiGO功能分类

3.1.4.1.1.1 分子功能分类

3.1.4.1.1.2 细胞成分分类

3.1.4.1.1.3 生物学途径分类

3.1.4.1.2 GOTM(Gene Ontology Tree Machine)树状图分析

3.1.4.2 通径分析(Pathway Analysis)

3.1.4.3 虚寒证相关代谢基因的染色体定位信息挖掘

3.1.4.4 中西医结合基因模糊系统分析

3.2 以药测证与疗效相关基因表达谱

3.2.1 疗效相关的差异基因表达谱

3.2.2 热药疗寒对虚寒证基因表达谱的影响

3.2.3 疗效相关基因的Gene Ontology信息挖掘

3.3 直接比较的信息挖掘

3.4 三种实验方案的结果比较

4.虚寒证的判别分析

4.1 建立支持向量机的判别模型

4.2 判别分析

5.虚寒证差异表达基因的临床验证

5.1 临床观察与样本的采集

5.2 差异表达基因的RT-PCR分析

5.2.1 试剂与仪器

5.2.2 RNA的提取

5.2.3 反转录反应

5.2.3.1 引物设计

5.2.3.2 逆转录反应

5.2.3.3 PCR扩增

5.2.3.4 验证结果

5.3 实时定量PCR分析

5.3.1 试剂及仪器

5.3.2 RNA的提取

5.3.3 实验步骤

5.3.3.1 反转录反应

5.3.3.2 PCR扩增

5.3.3.3 基因表达值的计算方法

5.3.4 验证结果

5.3.4.1 实时定量RT-PCR的电泳结果

5.3.4.2 实时定量RT-PCR的检测结果

6.讨论

6.1 “证候-基因表达谱”的方法学分析

6.1.1 病例的选择

6.1.1.1 从遗传学切入证候研究的意义

6.1.1.2 选择标准

6.1.1.3 结果分析

6.1.2 芯片实验

6.1.3 数据分析

6.1.3.1 预处理

6.1.3.2 差异基因分析

6.1.3.3 聚类分析

6.1.4 信息挖掘

6.1.4.1 GO

6.1.4.2 聚类与定位

6.1.4.3 通径分析(Pathway Analysis)

6.1.4.4 中西医结合基因模糊系统分析

6.2 虚寒证的基因表达谱分析

6.2.1 虚寒证与代谢基因表达谱

6.2.2 直接、间接比较与虚寒证的代谢基因表达谱

6.2.3 以药测证与虚寒证的差异表达基因

6.3 多学科结合的利与弊

6.4 虚寒证的判别分析及研究前瞻

6.5 虚寒证的差异表达基因与临床验证

6.5.1 临床病例的选择

6.5.2 RT-PCR验证

6.5.3 实时定量PCR验证

6.5.3.1 定量PCR方法的选择

6.5.3.2 POU3F4、PARP1基因的定量PCR验证

结语

参考文献

致谢

文献综述——证候的家系及客观化研究进展

1.证候的家系研究

1.1 家系证候的宏观症状调查

1.2 家系证候的生理、生化研究

1.3 家系证候的基因表达谱研究

2.寒证的研究进展

2.1 寒证与植物神经

2.2 寒证与能量代谢

2.3 寒证的基因表达谱研究

3.肾虚证研究进展

3.1 肾阳虚证与神经内分泌网络

3.2 补肾生血与β-地中海贫血

3.3 “肾为先天之本”与中医遗传学

4.血瘀证的研究进展

4.1 血管内皮细胞功能

4.1.1 血浆内皮素(ET)与一氧化氮(NO)平衡失调

4.1.2 血栓素A_2(TXA_2)与前列环素(PGI_2)平衡失调

4.1.3 纤溶酶原激活物(t-PA)与纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)平衡失调

4.1.4 血栓调节蛋白(Tm)

4.2 血小板功能变化

4.2.1 血栓素A_2(TXA_2)与前列环素(PGI_2)平衡失调

4.2.2 α颗粒膜蛋白(GMP-140)

4.2.3 血小板活化因子(PAF)

4.2.4 血小板膜表面GPⅡb／Ⅲa复合物

4.2.5 血小板膜糖蛋白CD_(62p)、CD_(63)

5.脾虚证的研究进展

5.1 脾虚证与消化系统关系的研究

5.2 脾虚证与内分泌相关研究

5.3 脾虚证与免疫相关研究

5.3.1 脾虚证与体液免疫

5.3.2 脾虚证与细胞免疫

5.4 脾虚证与生化相关研究

5.4.1 脾虚证与自由基

5.4.2 脾虚证与酶学指标

5.4.3 脾虚证与微量元素

参考文献

附件1：虚寒证自评量表

附件2：虚寒证他评量表

附件3：公开发表的学术论文、专著及科研成果

附件4：声明

发布时间: 2005-09-20

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